Science and Technology Production
Thesis
Authorship
Date
07/10/2008
Summary
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SIGEVA
Una de las causas más frecuentes de contaminación en la industria de los alimentos es la formación de biofilms ó biopelículas microbianas. La presencia de estas estructuras en las superficies de equipos y cañerías, comprometen la efectividad de los procesos de sanitización, causan contaminación del producto durante el proceso y afectan la operatividad de algunos equipos. Los ensayos realizados durante el desarrollo de esta tesis doc...
Una de las causas más frecuentes de contaminación en la industria de los alimentos es la formación de biofilms ó biopelículas microbianas. La presencia de estas estructuras en las superficies de equipos y cañerías, comprometen la efectividad de los procesos de sanitización, causan contaminación del producto durante el proceso y afectan la operatividad de algunos equipos. Los ensayos realizados durante el desarrollo de esta tesis doctoral tuvieron como objetivo general abordar el fenómeno de formación de biofilms de levaduras en equipos de producción de jugo concentrado de manzana con el propósito de lograr un mejor entendimiento del mismo y sugerir estrategias de control. A partir de los aislamientos realizados en las distintas muestras de jugo obtenidas en una planta productora de jugo concentrado de manzana localizada en el Alto Valle de Río Negro y Neuquén (AVRNN), se concluyó que los hongos fueron los microorganismos predominantes en las mismas. Se aislaron e identificaron cuatro cepas de levaduras: Kluyveromyces marxianus, Candida krusei, Zygosaccharomyces sp. y Rhodotorula rubra, que coinciden con aquellas consideradas por la bibliografía (Pitt y Hocking, 1997) como agentes de deterioro cuando los alimentos no se producen de acuerdo con las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM). El siguiente objetivo planteado en el transcurso de esta tesis fue caracterizar a las levaduras aisladas según sus propiedades fisicoquímicas de superficie, a fin de comprobar la hipótesis que éstas, conjuntamente con las características del medio de suspensión y las superficies abióticas, estarían relacionadas con el inicio de un biofilm. La correlación entre la adhesión y las propiedades de superficie estudiadas (carga de superficie celular, floculación, hidrofobicidad) se analizaron bajo la luz de los modelos teóricos propuestos derivados de la química de coloides y superficies: teoría DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek), teoría DLVO extendida (XDLVO) y aproximación termodinámica. En las condiciones de ensayo, los coeficientes de floculación y potencial zeta exhibidos por todas las levaduras no mostraron relación con la cinética de adhesión de las mismas sobre las superficies de acero inoxidable ensayadas. Resultó evidente al observar la cinética de adhesión de las cuatro cepas de levaduras que las interacciones electrostáticas por sí solas no explican la adhesión de las mismas. Por otra parte, los resultados determinaron que el porcentaje de hidrofobicidad expresado por las superficies de las células a pH 3.0 correlaciona positivamente con la velocidad de adhesión de cada cepa al acero inoxidable en presencia de jugo clarificado de manzana de 12 ºBrix. Una confirmación de lo discutido anteriormente se observó en la práctica con la modificación química del acero inoxidable en ensayos con recubrimientos hidrofóbicos (TEOS al 20 %) e hidrofílicos (SiO2). Se concluyó que, considerando las características hidrofóbicas del acero inoxidable, es razonable pensar que cuanto mayor sea la expresión de esta propiedad por parte de la superficie celular, mayor será la adhesión sobre este material. En condiciones industriales es importante conocer cómo el comportamiento de los líquidos que circulan a través de un sistema influye sobre la adhesión celular. A partir de la hipótesis que las condiciones de flujo modifican la adhesión celular a sustratos abióticos, uno de los objetivos propuestos fue diseñar en nuestro laboratorio una celda de flujo que nos permitiera estudiar la adhesión y colonización de las levaduras en estudio en flujo laminar para simular las situación de flujo en parte de las tuberías de conducción utilizadas en la industria. Los resultados de nuestros ensayos demuestran que las cuatro cepas de levaduras adhieren rápidamente en condiciones hidrodinámicas semi-estáticas (flujo estacionario) y de flujo laminar sobre superficies comúnmente usadas en plantas procesadoras de alimentos. La alta afinidad por el acero inoxidable demostrada por C. krusei y K. marxianus podría actuar, entre otros, como un factor de supervivencia y selección. Estas levaduras podrían estar colonizando las superficies de los tanques de clarificación y los accesorios de filtración, lo cual explicaría el alto recuento observado de las mismas en el jugo de manzana clarificado (muestra M3). En base a los resultados obtenidos se pudo afirmar que bajo condiciones hidrodinámicas de flujo laminar, la adhesión celular se ve modificada. Esto puede explicarse considerando que, durante la colonización y formación de biofilms, las células pueden experimentar modificaciones fenotípicas que favorecen el anclaje de las mismas a las superficies (Delissalde y col., 2004; Gilbert y col., 2003). Este fenómeno se evidencia en tiempos de contacto célula-sustrato relativamente largos, no así en las primeras horas de adhesión, donde predomina el efecto de las características fisicoquímicas de las células. Fue el caso de Zygosaccharomyces sp., donde las condiciones de flujo alteraron su morfología de desarrollo: de un patrón unicelular disperso en condiciones semiestáticas, evolucionó hacia una configuración seudomicelial en condiciones de flujo laminar. A fin de responder a la hipótesis planteada del efecto de los sistemas de sanitización sobre células iniciando un biofilm, se realizó la evaluación de la aplicación de dos desinfectantes habitualmente empleados en la industria sobre las cuatro cepas de levaduras en las distintas condiciones de crecimiento (planctónicas, sésiles y formando microcolonias) que podrían darse en una planta productora de jugo concentrado de manzana. Lo anterior nos llevó a plantearnos uno de los principales objetivos de esta tesis doctoral: desarrollar un ensayo simple, realista y reproducible para evaluar la efectividad de un desinfectante sobre células de levaduras autóctonas en activa colonización de superficies de acero inoxidable, imitando las condiciones a las que éstas se ven sometidas en la industria concentradora de jugo de manzana (matriz alimentaria, condiciones de flujo, temperatura y tiempos de contacto con las superficies de producción). Previamente, era necesario establecer el Efecto Microbicida (EM) para cada cepa de levadura a través de ensayos en suspensión frente a dos de los desinfectantes más comúnmente utilizados en la industria juguera: el hipoclorito de sodio y los compuestos de amonio cuaternario. Los resultados obtenidos muestran que el comportamiento frente a los desinfectantes de las cepas de levaduras estudiadas difiere significativamente según se encuentren adheridas a superficies o en desarrollo planctónico. Más aún, en el caso de las células iniciando un biofilm en condiciones de flujo laminar encontramos la mayor resistencia a la acción desinfectante del hipoclorito de sodio en las dos cepas ensayadas. En desarrollo planctónico se obtuvo el efecto microbicida esperado con la menor concentración de uso (0.20 g Cl/L), mientras que sobre células adheridas en condiciones de flujo estacionario (poco o ningún esfuerzo de corte) fue necesario duplicar la dosis (0.50 g Cl/L). En el caso de Zygosaccharomyces sp., para obtener un EM > 3 en los ensayos de colonización en condiciones de flujo laminar, fue necesario combinar la acción de un detergente alcalino microbicida con la mayor concentración de hipoclorito de sodio ensayada. Estos resultados muestran claramente que la evaluación de la eficacia de un desinfectante sobre biofilms debe ser realizada utilizando un método donde la adhesión y colonización de las células se lleve a cabo en condiciones de flujo similares a las del entorno donde se aplicará el desinfectante, y que aún utilizando superficies nuevas y realizando las secuencias de limpieza y sanitización en condiciones óptimas, existe el riesgo de que el número de células viables remanentes sobre las superficies puedan generar un nuevo biofilm.
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Key Words
BIOFILMSJUGO DE MANZANALEVADURAS