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Libro de actas - Hidrólisis de rafinosa mediante una α galactosidasa inmovilizada como un modelo de la hidrólisis de melaza de soja para su uso como sustrato para la producción de bioetanol
Congreso
Date:
2016Publishing House and Editing Place:
UNQSummary *
1. Introducción La producción de soja se encuentra enmarcada dentro de un sistema productivo que no puede ser analizado de manera aislada. Un gran número de factores políticos y de mercado, tanto local como internacional, explican su desarrollo y crecimiento a lo largo del planeta. El complejo sojero argentino es uno de los sectores más dinámicos de la economía del país, generando cerca del 30% de divisas que ingresa de las exportaciones y que representa el 30% del PBI del sector agro industrial. El sector agrícola y las industrias que de él dependen, producen enormes cantidades de desechos, que pueden convertirse en materias primas y co-productos, para ser utilizados como substratos económicos en procesos fermentativos (Solaiman et al., 2006). Las melazas obtenidas de varias plantas (azúcar de caña, azúcar de remolacha, almidón de maíz, etc.) se utilizan como materia prima para la producción de bioetanol, proceso que presenta el impedimento de que utiliza productos alimenticios como sustrato. Por lo tanto, es de suma importancia el desarrollo de procesos de fermentación que utilicen fuentes económicas de carbono para la producción de etanol a escala comercial (Siqueira, 2008). La melaza de soja, obtenida como desecho en la producción de proteína texturizada, contiene grandes cantidades de azúcar, en especial sacarosa, glucosa, estaquiosa y rafinosa. Estas dos últimas, representan casi el 50% de los azúcares presentes y resultan imposibles de fermentar por Saccharomyces cereviseae (Romao et al., 2012) salvo que sean sometidas previamente a un proceso de hidrolisis. La α-galactosidasa (α-Gal), cataliza la hidrólisis de uniones α-(1,6)-glicosídicos entre residuos de galactosa en oligosacáridos sencillos como la melibiosa, rafinosa y estaquiosa liberando residuos de galactosa que son fermentables por S cer.La inmovilización de enzimas es un proceso por el cual se restringe, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de la enzima por su unión a un soporte, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamenteEl objetivo del presente trabajo fue estudiar la inmovilización de la enzima α galactosidasa en una matriz de alginato de calcio, caracterizar a la enzima inmovilizada y estudiar la hidrólisis de rafinosa en sistemas por lote y en continuo.2. MetodologíaLa enzima α galactosidasa (α Gal) utilizada para los experimentos fue de grado alimentario. La rafinosa fue adquirida a Anedra. Todos los demás reactivos fueron de grado analítico.La actividad enzimática fue determinada midiendo la aparición de poder reductor por el método de Somogyi Nelson utilizando rafinosa como sustrato y fructosa como patrón. La enzima libre y la inmovilizada fue caracterizada midiendo su estabilidad frente a pH y temperatura, su pH óptimo, su estabilidad frente a distintos cationes tales como Mg+2, Zn+2, Fe+2, Mn+2, Ca+2, Cu+2, Mg+2, Zn+2, Fe+2, Mn+2, Ca+2 y Cu+2 y frente a alcoholes (debido a que la melaza se obtiene por extracción hidroalcoholica de la harina de soja) y sus constantes cinéticas.La enzimas fue inmovilizada por entrampamiento, a través del método de gelificación ionotrópica con alginato de calcio. Para ello, se disolvieron 5 g del preparado de enzima comercial (CA 1000 U/g) en 100ml de agua destilada. Se mezcló con una solución de alginato de sodio al 3 % p/v en solución fisiológica (NaCl 0.9 % p/v) y se vertió por goteo sobre una solución de CaCl2 al 2 %. Se agregaron 10ml de glutaraldehído 25 %. Se dejó reposar 20 minutos a temperatura ambiente, se filtraron las esferas formadas y se realizaron 3 lavados con agua destilada. Se tomaron muestra de las soluciones antes de filtrar y luego de cada lavado para estudiar el posible efecto de leaching. Se obtuvieron esferas con un diámetro promedio de 3,9 mm. Se guardaron en heladera, suspendidas en buffer BCP con CaCl2 al 2 %.La enzima fue utilizada en continuo, empacada en una columna (flujo pistón) y en un reactor de mezclado perfecto. En ambos casos se estudió la posible existencia de problemas difusionales evaluando el valor del módulo de Thiele observable y analizando los resultados de acuerdo al criterio de Weisz (Doran P. 1995).3. Resultadosy DiscusiónLa enzima libre resultó ser es ser estable hasta los 60 ºC (por 180 minutos), tener una temperatura óptima de 50 ºC y un pH óptimo de 5, un Km de 16 mM (para rafinosa) y un Vmax de 0.612 µmoles.ml-1.min-1. Resultó ser estable frente a metanol hasta una concentración de 10% v/v mientras que los cationes produjeron una disminución de entre 50 y 70 % en la actividad, luego de la incubación de la enzima con concentraciones 10 mM de los mismos por 60 minutos. La enzima resulto ser muy estable a bajas temperaturas, manteniendo más del 90 % de la actividad luego de 100 días a 4ºC.Con respecto a la enzima inmovilizada, mantuvo los valores de estabilidad frente a la temperatura y temperatura optima pero, si bien también mantuvo el valor del pH optimo, la enzima fue más activa que la libre a valores mayores y menores que el optimo (entre pH 3 y 6). El valor del Km disminuyo significativamente hasta un valor de 4.8, indicando un aumento de la afinidad de la enzima por el sustrato.La enzima inmovilizada fue reusable por 6 veces, incrementando ligeramente la actividad con los sucesivos tratamientos pero, luego de ese número de cambios entre buffer y buffer con sustrato, las bolillas comenzaron a desintegrarse.Cuando la enzima inmovilizada fue utilizada en modo continuo en columna (flujo pistón) se observo que la productividad de galactosa se incrementó con el aumento de la concentración de sustrato (entre 2 y 20 g/l) aunque no varió con los cambios de caudal entre 100 y 500 ml/h. Dado que el volumen muerto de la columna en las condiciones de llenado fue de 25 ml, estos flujos representan tiempos de retención de entre 0.25 y 0.05 horas. En estas condiciones de flujo y concentración de sustrato, no se consiguieron porcentajes de hidrólisis mayores de 45 %. Los valores del módulo de Thiele para las diferentes condiciones de trabajo fueron siempre menores que 0.3 por lo que puede asegurarse que los bajos valores de conversión no son debidos a problemas de difusión interna en las bolillas.La enzima fue utilizada también en continuo en condiciones de mezclado perfecto. En este caso el volumen de líquido del reactor fue de 150 mL. La experiencia se realizó en las mismas condiciones de flujo y concentración de sustrato por lo que el tiempo de retención varió entre 1.66 y 0.3 horas. Al igual que en el sistema en columna, la productividad de la reacción se incrementó con el aumento de la concetracion de sustrato y en este caso si se vieron cambios en el % de conversión, siendo de 100 % para el flujo de 150 ml/h y de un 35 % a 500 ml/h. Como es de esperar, y dado que los tiempos de retención en el sistema de mezclado perfecto son mayores que en el sistema de flujo pistón, tanto el porcentaje de conversión como la productividad son mayores en el primero. Esto es debido a que el sustrato está sistemáticamente más tiempo en contacto con la enzima. El modulo de Thiele fue calculado también en estas condiciones indicando, para los flujos de 250 y 50 ml/h que no hubo problemas de difusión (a flujos de 100 ml/h, como el porcentaje de conversión fue de 100% no pudo calcularse la velocidad de reacción aparente por lo que no pudo calcularse el modulo).5. ConclusionesDel presente trabajo puede concluirse que la α galactosidasa, en condiciones de inmovilización, es una buena opción para hidrolizar la refinosa y la estaquiosa presentes en la melaza de soja, permitiendo de esta forma utilizar dicho residuo para la producción de bioetanol por fermentación Information provided by the agent in SIGEVAKey Words
BioetanolMelaza de sojaRafinosa