Science and Technology Production
Thesis
Authorship
Date
01/01/2005
Summary
Information provided by the agent in
SIGEVA
Las levaduras son hongos unicelulares, que se reproducen asexualmente por gemación y se caracterizan por la ausencia de hifa ascógena y ascocarpo. Estos microorganismos tienen la capacidad de llevar a cabo dos tipos de metabolismos distintos, la respiración (aeróbico) y la fermentación (anaeróbico). La fermentación del mosto en vino es un complejo proceso bioquímico y ecológico que suele desencadenarse de forma natural a partir de l...
Las levaduras son hongos unicelulares, que se reproducen asexualmente por gemación y se caracterizan por la ausencia de hifa ascógena y ascocarpo. Estos microorganismos tienen la capacidad de llevar a cabo dos tipos de metabolismos distintos, la respiración (aeróbico) y la fermentación (anaeróbico). La fermentación del mosto en vino es un complejo proceso bioquímico y ecológico que suele desencadenarse de forma natural a partir de las propias levaduras, bacterias, hongos filamentosos y sus virus específicos presentes en el mosto y en los equipamientos de las bodegas. Se caracteriza porque en el transcurso de la misma intervienen varias especies de levaduras, algunas de las cuales coexisten en el tiempo y otras se suceden secuencialmente en función, sobretodo, de sus resistencias al etanol. Sin embargo, sólo unas pocas cepas de Saccharomyces cerevisiae logran controlar la mayor parte de la fermentación, convirtiéndose en el principal organismo que se emplea en las vinificaciones. Una interacción del tipo antagónico es el fenómeno killer, el cual tiene particular relevancia desde el punto de vista biotecnológico. En la práctica enológica el fenómeno killer juega un rol importante en el balance de las poblaciones salvajes de las levaduras. Este fenómeno está basado en la secreción por parte de las levaduras killer de una proteína tóxica (llamada toxina killer), la cual mata a células denominadas sensibles, que pueden ser del mismo género de levaduras o relacionado. En el presente trabajo, mediante interacciones entre cepas elegidas sobre la base de ensayos previos, se identificaron aquellas que secretan la toxina killer y quiénes son sensibles a la misma. Los resultados de la interacción K/S entre las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae ensayadas y a nivel de actividad tóxica en los test de well mostraron alta especificidad. Uno de los objetivos de este capítulo fue seleccionar aquellas cepas de levaduras killer y sensibles que muestran espectro killer más amplio y sensibilidad frente a una mayor cantidad de cepas killer respectivamente, para poder llevar a cabo los estudios posteriores. Se realizó un ensayo de estabilidad de la toxina a diferentes pH con 4 cepas seleccionadas en la etapa anterior, el cual tuvo como finalidad determinar cuanto tiempo puede permanecer activa la proteína tóxica secretada por la cepa killer en el medio de cultivo. Cuando se estudiaron cepas capaces de secretar la suficiente cantidad de toxina como para medir su actividad independientemente de las células, se verificó en la cepa salvaje BSc400 (Biotecnología Saccaromyces cerevisiae 400) la dependencia de la estabilidad de la toxina respecto del tiempo y el pH. El estudio del comportamiento de las cepas puras, BSc400 (killer) y BSc377 (sensible), o en cultivos mixtos K/S (condición A: 50% BSc400/ 50% BSc377 y B: 10% BSc400/ 90% BSc377), en biorreactores con sistemas de cultivo agitados por lote (batch), se llevó a cabo a través del seguimiento de curvas de crecimiento. En cultivos puros, desde el comienzo, la cepa BSc377 mostró mayor crecimiento celular que la cepa BSc400, además, difieren en el inicio de sus fases exponenciales de crecimiento. Esto puede estar ligado al hecho de que las levaduras de la cepa killer requieren un periodo de tiempo mayor para lograr adaptarse a las condiciones del medio y poder dar comienzo a la fase exponencial de crecimiento. Cuando se compararon las velocidades máximas específicas de crecimiento (µmax) en condición aeróbica de estas dos cepas se verificó que la de la cepa sensible es superior a la de killer. Este tipo de comportamiento podría relacionarse con un empleo mayor de energía por parte de la célula para la génesis y el funcionamiento del fenotipo killer. En la condición experimental A, µmax coincide con la de la cepa killer, lo cual sugiere el dominio de ésta sobre la cepa sensible, infiriendo que la situación de competencia entre las cepas no afectaría la velocidad de multiplicación de la condición A durante el proceso. Con respecto a la prevalencia de la cepa killer, esta se hace evidente a partir de los 360 min del experimento y continúa en forma sostenida hasta el final del ensayo. Si bien el dominio de la cepa con fenotipo killer fue significativo esta no pudo eliminar en forma completa a la cepa sensible. En la condición B, la cepa killer dominó parcialmente a partir de los 630 min. Este hecho se ve reflejado en la µmax obtenida en esta condición experimental, el cual es un valor intermedio respecto de los obtenidos para las cepas puras. En condiciones experimentales aeróbicas, la interacción entre cepas killer y sensibles salvajes, no implicó una disminución de la velocidad de multiplicación de las poblaciones que intervienen en la situación de competencia. El comportamiento fermentativo de las cepas BSc400 (killer) y BSc377 (sensible) se evaluó a través de microvinificaciones en cultivos puros y mixtos K/S (A y B). Con respecto a la producción de CO2, el comportamiento fermentativo en ambas microvinificaciones mixtas K/S y puras BSc400 y BSc377 no presentan diferencias significativas en el tiempo. Dichas curvas se solapan hasta las 168 h y aproximadamente a partir de las 360 h se estabilizan hasta el final del experimento. Respecto de la velocidad de producción de CO2, los cultivos mixtos comenzaron a disminuir su velocidad de producción a las 96 h de iniciado el experimento, mientras que los cultivos puros lo hicieron 24 h después. Como producto final, las fermentaciones mixtas bajo las condiciones A y B sólo disminuyen en un 8,7% y 5,8% respecto a la cepa sensible. Con relación a la cepa killer BSc400, las condiciones A y B disminuyeron la producción de CO2 un 13,7% y 11% respectivamente. Estos resultados pueden corresponderse con una situación de competencia entre ambas cepas de fenotipos distintos a lo largo del proceso de fermentación. Los resultados sugieren que los factores de competencia, aún en presencia del factor killer, pueden ser diversos. La proporción menor de azúcares residuales obtenidos en las fermentaciones de la cepa killer y, con valores similares, en la condición experimental K/S A al final de la vinificación, podría atribuirse a un mayor consumo de fuente de carbono por parte de la cepa portadora del carácter killer ya sea para la producción y secreción de la toxina, como también para el mantenimiento de la parte de la célula encargada de la manufactura de la misma. En cuanto al rendimiento, teniendo en cuenta la cantidad de azúcar consumida y la biomasa producida, quienes obtuvieron los valores finales mayores fueron la cepa killer BSc400 y ambas condiciones experimentales mixtas K/S. Se analizó la proporción de colonias killer y sensibles en ambas fermentaciones mixtas K/S sembrando en los medios YEPD-Agar y Mosto-Agar. En las dos condiciones y en ambos medios, se observó que la población killer aumentó a las 12 h del comienzo de la fermentación, manteniéndose en niveles superiores al 90% hasta aproximadamente las 360 h donde luego comenzó a aumentar la proporción de las levaduras sensibles con respecto a las killer, manteniéndose esa situación hasta el final del experimento (672 h). Con relación a los dos medios de incubación empleados (YEPD-Agar y Mosto-Agar), la proporción de células con actividad tóxica en mosto fue la mayoría de las veces menor que la expresada en YEPD, no obstante se lograron valores consistentemente altos en mosto. De esta manera, la mayor proporción de colonias de levaduras killer desarrolladas sobre el medio YEPD- Agar puede implicar que otros investigadores en estudios anteriores hayan infraestimado la influencia de la cepa con fenotipo sensible en cultivos mixtos K/S. Sobre la base de los antecedentes analizados y por los resultados presentes, se infiere que es probable que la composición del medio, las condiciones de fermentación o la sensibilidad de las cepas sea lo que marque las diferencias en el dominio de la fermentación por parte de una cepa killer. Se desarrolló un sistema de monitoreo de biomasa durante el proceso fermentativo (microvinificaciones mixtas) y crecimiento celular mixto empleando sistemas de anulación de la toxina de las cepas, de forma de reflejar el estado de stress en el que se encuentra la cepa killer (BSc400) en los medios de desarrollo empleados (YEPD- Agar y Mosto- Agar). En general, puede observarse que la proporción de células con fenotipo killer disminuye respecto de las susceptibles (BSc377) cuando las muestras se incuban a 37°C, temperatura a la cual la toxina se encuentra inactiva. De esta manera puede evaluarse en forma precisa las proporciones de cepas killer y sensibles en el biorreactor, evitando las distorsiones que se producen durante el crecimiento en placa de células próximas y por lo tanto susceptibles de ser eliminadas por la toxina.
Show more
Show less
Key Words
VINOLEVADURAS SENSIBLESLEVADURAS KILLER