Inmunización génica de ratones machos con la secuencia codificante de Proacrosina humana

Tesis

Resumen *

INTRODUCCIÓN. Acrosina es una serina-proteasa, que se expresa de manera específica en los espermatozoides durante la espermatogénesis y se almacena en forma de zimógeno, proacrosina, en el acrosoma del espermatozoide. Actualmente, se acepta que proacrosina/acrosina es un sistema multifuncional que participaría en la penetración de la zona pellucida, a través de la interacción y digestión de los componentes de la misma, así como en la liberación coordinada de enzimas de la matriz acrosomal durante la exocitosis acrosomal. Asimismo se ha descripto una asociación entre la presencia de anticuerpos antiespermáticos en plasma y la infertilidad masculina sin causa aparente. A pesar de la relevancia de este sistema, la presencia de una respuesta inmune contra acrosina asociada a casos de infertilidad así como su empleo en el desarrollo de modelos animales de inmunidad no han sido estudiados en forma exhaustiva. El estudio del efecto de los anticuerpos antiacrosina sobre las funciones de la proteína y el proceso de fecundación se propone como estrategia para comprender algunos aspectos de la infertilidad así como el rol de la proteína en la fecundación. OBJETIVOS. Determinar la capacidad del sistema proacrosina/acrosina de inducir inmunidad en ratones machos de la cepa CF1 y estudiar la participación de anticuerpos antiacrosina asociados a la infertilidad masculina, mediante un modelo animal de inmunización génica (IG) con la proteasa acrosomal proacrosina. MATERIALES Y MÉTODOS. Se inmunizaron ratones machos CF1 y Balb/c (n=16) con un plásmido de expresión eucariota (pSF2-Acro) conteniendo la secuencia codificante (ADNc) de h-proacrosina. Se evaluó la respuesta inmune humoral de los animales inmunizados frente a la inmunización génica a través de la determinación de los niveles de anticuerpos antiacrosina en sueros, empleando un ensayo de ELISA indirecto. En la semana 15 del protocolo de inmunización, los animales inmunizados fueron apareados con hembras de la misma edad no tratadas y de fertilidad comprobada, en una relación 1:1 (en Balb/c) y 1:3 (en CF1), luego de haberse determinado la respuesta contra proacrosina humana recombinante. Al término del estudio de fertilidad in vivo, los ratones machos fueron sacrificados por dislocación cervical, se extrajo sangre por punción cardíaca, se obtuvieron los testículos y se recuperaron los espermatozoides provenientes del cauda epididimario para analizar si la inmunización génica había afectado la calidad espermática (cuenta y motilidad espermática). Para finalizar se compararon los resultados de la cepa CF1 con los obtenidos en la cepa Balb/c. RESULTADOS. La respuesta humoral frente a h-proacrosina evaluada en función del tiempo reveló un incremento significativo en los ratones machos CF1 inmunizados del grupo pSF2-Acro respecto de los controles en todos los puntos estudiados a partir de la semana 8 del plan de inmunización. Al momento de la finalización del protocolo de inoculación, durante la semana 14 los niveles de anticuerpos específicos anti proacrosina/acrosina generados fueron significativamente mayores en el grupo pSF2-Acro respecto al grupo control pSF2 (pSF2-Acro: 18,51±4,09 | pSF2: 1,29±0,19; p<0,05; Prueba de Mann-Whitney). La respuesta humoral en función del tiempo para cada animal inoculado con pSF2-Acro reveló que cinco de seis ratones mostraron una tendencia ascendente y sólo uno mostró una respuesta sostenida del nivel de anticuerpos manifestando pequeñas variaciones hacia el final del período de seguimiento. La respuesta humoral se asoció con una tendencia a la disminución de la fertilidad: la fertilidad en el grupo control fue del 100% (4/4) mientras que el 67% (4/6) de los animales inmunizados con pSF2-Acro fue fértil. Si bien, esta diferencia no alcanzó la significancia estadística (p>0,05%; Prueba de Fischer), los resultados muestran una tendencia a una disminución de la fertilidad en los animales inmunizados con el plásmido pSF2-Acro. Sin embargo, el número de crías por animal observados en el grupo pSF2-Acro (25/4) fue significativamente menor respecto del obtenido en el grupo control (41/4) (p<0,05; Prueba de Mann-Whitney). Además se observó una correlación entre los niveles de anticuerpos anti-proacrosina y el número de crías nacidas vivas. Por otra parte, la inmunización génica no generó efectos secundarios adversos. CONCLUSIONES. Se demostró que es posible generar inmunidad adquirida contra un antígeno espermático, el sistema proacrosina/acrosina, mediante el empleo de inmunización génica, en un modelo animal que hasta el momento no ha sido reportado para este tipo de metodología, como lo es la cepa CF1. La inmunización génica contra proacrosina humana redujo considerablemente la fertilidad de los ratones machos CF1 inmunizados respecto al grupo control. La IG afectó la fertilidad de los animales observándose una correlación lineal inversa entre los niveles de anticuerpos séricos específicos y el número de crías nacidas vivas. Por otra parte no generó efectos secundarios sobre el estado físico de los ratones, sobre la calidad espermática o sobre las crías. Información suministrada por el agente en SIGEVA