Funciones de las células gliales de Müller durante el desarrollo de la retina. CODIRECTORA

Producción CyT

Tesis

Autoría

ROTSTEIN, NORA PATRICIA

Fecha

01/01/2006

Resumen Información suministrada por el agente en SIGEVA

FUNCIONES DE LAS CÉLULAS GLIALES DE MÜLLER DURANTE EL DESARROLLO DE LA RETINA En muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina, la muerte de las neuronas fotorreceptoras conduce irreversiblemente a la ceguera, sin que existan tratamientos efectivos para estas enfermedades. Entre las estrategias terapéuticas posibles, se ha propuesto evitar la muerte neuronal o generar nuevas neuronas, y las células gliales podrían desempeñar un rol central en ambos ... FUNCIONES DE LAS CÉLULAS GLIALES DE MÜLLER DURANTE EL DESARROLLO DE LA RETINA En muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina, la muerte de las neuronas fotorreceptoras conduce irreversiblemente a la ceguera, sin que existan tratamientos efectivos para estas enfermedades. Entre las estrategias terapéuticas posibles, se ha propuesto evitar la muerte neuronal o generar nuevas neuronas, y las células gliales podrían desempeñar un rol central en ambos procesos. Estas células han sido propuestas como potenciales generadoras de nuevas neuronas ante procesos degenerativos en la retina. Por otra parte, las células gliales cumplen funciones relevantes para el mantenimiento de la integridad funcional de la retina. Las células gliales de Müller constituyen las principales células gliales de la retina neural, y se extienden a través de todo el espesor de la retina, conectando y envolviendo todos los tipos de células neuronales presentes en ella. Esta localización permite múltiples interacciones funcionales entre las neuronas y este tipo de células gliales en la retina, hallándose relacionadas con la supervivencia neuronal, el procesamiento de la información visual y la homeostasis extracelular. En este trabajo de tesis se han estudiado aspectos relacionados con el posible rol de las células gliales de Müller como células multipotentes en la retina, los factores y mecanismos que controlan la proliferación, tanto en estas mismas células como en los neuroblastos de retina en cultivo y el papel que cumplen las células gliales de Müller en la supervivencia y diferenciación de las neuronas fotorreceptoras y amacrinas, dos de las poblaciones neuronales de la retina, en cultivo. Se utilizó como modelo experimental la retina de rata, empleando cultivos de células neuronales y gliales, desarrollados en el laboratorio. Como parte de este trabajo de tesis se perfeccionaron las condiciones de cultivo para obtener células de Müller puras. En primera instancia se identificaron y caracterizaron las células gliales en cultivo, mediante criterios morfo-histológicos, e inmunocitoquímicos, utilizando los anticuerpos CRALBP y GFAP, marcadores extensamente utilizados en conjunto, para la identificación de células gliales de Müller. Estos estudios permitieron establecer que las células gliales obtenidas en cultivo son efectivamente células de Müller, el tipo glial mayoritario de la retina. Se estudió primeramente la capacidad de las células gliales de preservar características de células toti y/o multipotentes. Para esto se investigó la expresión del filamento intermedio nestina, marcador de dichas células. Para analizar la capacidad proliferativa in vitro de las células de retina, tanto gliales como neuronales, se investigaron marcadores de la progresión del ciclo celular, como la incorporación de bromo deoxiuridina (BrdU), y de otros reguladores del ciclo celular como la ciclina PCNA, y la proteína p27kip1. A tiempos tempranos de cultivo y en un medio suplementado con suero fetal bovino (SFB), prácticamente todas las células gliales expresaron nestina y la mayoría de ellas incorporaron activamente BrdU. A medida que las células se fueron diferenciando, la expresión de nestina se tornó difusa, a la vez que disminuyó la capacidad proliferativa, decreciendo el porcentaje de células que incorporaron BrdU del 85% a los 3 días in vitro (div), al 3% a los 21 div. Cuando las células se sembraron en un medio de diferenciación (MD) químicamente definido, sin suero, perdieron rápidamente su capacidad proliferativa. Sólo aquellas células que expresaron nestina fueron capaces de incorporar BrdU y dividirse. Estos resultados sugieren que las células gliales proliferaron activamente en los primeros estadios de desarrollo en cultivo, pero perdieron esta capacidad a medida que transcurría su desarrollo y diferenciación in vitro. Por otra parte, moléculas mitogénicas presentes en el suero estimularon la proliferación glial. Para identificar posibles agentes mitogénicos, se investigaron los efectos de distintos factores tróficos, incluyendo el factor neurotrófico derivado de la glia (GDNF), el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), la insulina y el ácido docosahexaenoico (ADH) sobre la proliferación glial. Primeramente se determinó, tanto por citoquímica como por western blot, que las células gliales de Müller en cultivo expresaron GDNF. Tanto el GDNF como el bFGF estimularon la proliferación de las células gliales de Müller, siendo el GDNF un promotor de la proliferación glial más efectivo que el bFGF. En un medio de diferenciación, la disminución en la proliferación glial fue paralela a un aumento en la expresión de una proteína inhibidora del ciclo celular, la p27kip1. Por el contrario, tanto el GDNF como el agregado de suero disminuyeron la expresión de p27kip1. En relación a la insulina, pudimos determinar que también fue capaz de aumentar la proliferación de las glias de Müller, ya que su agregado promovió la incorporación de BrdU en las células gliales. Este efecto puedo observarse a una concentración 1M, semejante a la necesaria para promover la supervivencia de las neuronas amacrinas (Politi y col., 2001c). Por su parte, la suplementación de los cultivos gliales con ADH, el ácido graso poliinsaturado más abundante de la retina, que se identificara en el laboratorio como un factor trófico para los fotorreceptores (Rotstein y col., 1996, 1997), frenó la proliferación glial, disminuyendo la incorporación de BrdU, modificando los patrones de expresión de nestina, tornándose ésta más difusa, y aumentando la expresión de p27kip1. Estos resultados sugieren que la capacidad proliferativa de las células gliales de Müller puede ser regulada por moléculas liberadas por las propias células gliales y/o por células de su entorno, y han permitido identificar a moléculas reguladoras del ciclo celular de las células de Müller, tanto estimuladoras de la proliferación, como GDNF, el bFGF y la insulina e inhibidoras como el ADH. La notable capacidad de las células gliales de Müller para preservar su potencial replicativo fue evidenciado por la obtención de subcultivos/cultivos secundarios de estas células. Dichos cultivos fueron obtenidos a partir de cultivos gliales puros, mediante procedimientos mecánicos o enzimáticos, y se determinó que las células re-sembradas conservaron la capacidad de incorporar BrdU y expresar nestina. Además se investigó si era posible recuperar la capacidad proliferativa de las células gliales de Müller una vez que éstas abandonaran el ciclo celular. El agregado de medio con suero o de GDNF a cultivos gliales que mostraban muy escasa incorporación de BrdU, aumentó notablemente esta incorporación, recuperándose el patrón de expresión de nestina característico de células en proliferación. A su vez, la insulina también promovió el re-ingreso al ciclo celular de las células gliales que habían pasado a un estado no proliferativo. Esto sugiere que las células gliales de Müller saldrían del ciclo celular, permaneciendo en un estado quiescente, pero conservando la capacidad de proliferar, y podrían re-entrar al ciclo en respuesta a agentes autócrinos o parácrinos. La disminución en los niveles de los indicadores de proliferación fue acompañada por un aumento concomitante en la expresión de marcadores de diferenciación, como la proteína CRALBP, cuya expresión aumentó paulatinamente durante el transcurso del desarrollo en cultivo. El agregado de GDNF disminuyó la expresión de CRALBP. Esto sugiere que la pérdida de la capacidad proliferativa estaría estrechamente asociada a la mayor diferenciación glial. Durante la formación del ojo, existen genes ?maestros? que controlan el normal desarrollo de la retina, uno de los cuales es el gen Pax-6. Teniendo en cuenta el rol propuesto de células madre y su capacidad de diferenciarse en neuronas, las células gliales de Müller deberían expresar este gen, de modo de recapitular el desarrollo de la retina para llevar a cabo un proceso regenerativo. Se estudió el rol del Pax-6 en las células gliales de Müller y su posible relación con el potencial regenerativo como células madre, en cocultivos neuro-gliales y en cultivos puros. En etapas tempranas del desarrollo las células de Müller coexpresaron Pax-6 con nestina, observándose posteriormente una disminución progresiva y paralela en la expresión de ambas proteínas, así como en la incorporación de BrdU. Estos cambios se correspondieron con un aumento en la expresión de CRALBP. La expresión de Pax-6 pudo ser preservada por interacción con neuronas en cocultivo o restituida adicionando factores tróficos como el GDNF, el bFGF y la insulina. En relación a la acción de la insulina, nuestros resultados sugieren que contribuiría a un aumento de Pax-6 en las células gliales de Müller de dos maneras diferentes: una directa, por interacción con la glia, y otra indirecta, por estimulación de las neuronas de la retina, las cuales a su vez incrementarían esta expresión en las células de Müller. Eso permite proponer que la expresión de Pax-6 está vinculada a la preservación de las características multipotentes y a la potencialidad proliferativa de las células gliales y que para su preservación es crítica la interacción neuro-glial y el soporte trófico adecuado. Profundizando en el estudio de la función que cumplirían las células gliales de Müller en la supervivencia y diferenciación de neuronas de la retina, iniciado en mi tesina de pre-grado, se determinó que las células de Müller postergaron la muerte por apoptosis de las neuronas fotorreceptoras en cultivo, que ocurre en ausencia de los factores tróficos específicos necesarios para su supervivencia. Se indagó además si las células gliales de Müller podían regular también el desarrollo y diferenciación de las neuronas de retina. En las neuronas fotorreceptoras, la presencia de células de Müller o de medio condicionado glial (MCG) obtenido de dichas células estimuló la expresión de opsina, la proteína involucrada en la transducción del impulso luminoso en impulso eléctrico, y el desarrollo de procesos apicales. El agregado de GDNF tuvo un efecto semejante, promoviendo la diferenciación de las neuronas fotorreceptoras. Las células gliales estimularon el crecimiento de neuritas en neuronas fotorreceptoras y amacrinas: en cocultivos neurogliales, las neuritas de estas neuronas tuvieron una longitud mayor que en cultivos neuronales puros, y crecieron en forma trópica, es decir, orientados hacia las células de Müller. Esto sugiere que estas células liberarían moléculas que promueven el crecimiento y el guiado axonal. Por otra parte, se analizó la capacidad proliferativa de los progenitores neuronales y la regulación de dicha capacidad. Se determinó que los neuroblastos de retina expresaron nestina mientras permanecieron en el ciclo celular, pero al iniciar el proceso de diferenciación perdieron la expresión de nestina y su potencial mitogénico. Las células de Müller permitieron preservar la expresión de nestina en neuroblastos, de manera tal de contribuir al mantenimiento de un grupo o pool de células en condiciones de-diferenciadas, con la potencial capacidad de diferenciarse luego en otros elementos de la retina. En efecto, estudios previos y actuales llevados a cabo en el laboratorio (Rotstein y col., 1998; Politi y col., 2001b; Insua y col., 2003) han demostrado que tanto el GDNF como el ADH, promueven la permanencia en el ciclo celular de los neuroblastos y la salida del mismo, respectivamente. De modo análogo, hemos observado estos efectos también en el control del ciclo celular de las células gliales de Müller. Muchos procesos oxidativos que ocurren en la retina, ocasionan un daño considerable en el funcionamiento de la misma y se ha propuesto un rol protector para las células gliales de Müller ante dicho daño. Se investigó si estas células eran capaces de proteger a las neuronas de retina del daño oxidativo, inducido con el oxidante Paraquat (PQ), ya que este oxidante provoca la apoptosis de neuronas de retina en cultivo (Rotstein y col., 2003). Las células gliales de Müller evidenciaron mayor resistencia que las neuronas frente al daño oxidativo, ya que mantuvieron la funcionalidad mitocondrial (determinada con la sonda fluorescente MitoTraker) y la integridad nuclear aún después de ser tratadas con PQ. El agregado de PQ aumentó la incorporación de BrdU y la expresión de PCNA, disminuyendo la expresión de CRALBP, sugiriendo que el daño oxidativo promovió la proliferación glial, induciendo además su de-diferenciación. A su vez, las células gliales de Müller ejercieron un rol neuroprotector, protegiendo a las neuronas amacrinas del daño oxidativo. En conclusión, los resultados obtenidos en esta tesis permiten establecer que: 1) Las técnicas desarrolladas en el laboratorio permiten obtener cultivos puros de células gliales de Müller, que mantienen su capacidad mitogénica y características de células multipotentes, como la expresión de nestina, durante aproximadamente 30 días en cultivo. Aún los cultivos secundarios o repiques de dichas células conservan su potencial mitótico y expresan nestina. 2) El potencial mitogénico de estas células puede ser regulado por factores tróficos: GDNF, bFGF, e insulina promueven la proliferación y el re-ingreso de las células de Müller al ciclo celular, mientras que el ADH estimula la salida del ciclo. 3) Las células gliales de Müller podrían cumplir un rol en el mantenimiento de un pool de neuroblastos capaces de diferenciarse como neuronas de retina, ya que preservan la expresión de nestina en los neuroblastos en cocultivo. 4) Las células gliales liberarían factores tróficos que controlan el ciclo celular en los progenitores de fotorreceptores, y ejercen funciones análogas a las observadas en las células gliales: el GDNF promueve la permanencia en el ciclo celular, y el ADH induce la salida del ciclo y el inicio de la diferenciación. De esta forma, tanto el GDNF como el ADH serían señales extrínsecas necesarias para definir, al menos in vitro, el tamaño inicial de la población de fotorreceptores. 5) Las células gliales de Müller estimulan la supervivencia de las neuronas fotorreceptoras, produciendo factores involucrados tanto en la regulación de la supervivencia como en la diferenciación de las mismas. El GDNF estimula la diferenciación de fotorreceptores in vitro, incrementando la expresión de opsina, y promoviendo el crecimiento de segmentos apicales. Además las células de Müller guían y promueven el crecimiento de axones tanto de neuronas amacrinas como de fotorreceptores de retina en cultivo. 6) Las células gliales de Müller expresan Pax-6 mientras están proliferando activamente, y esta expresión disminuye a medida que se diferencian, requiriendo de la interacción con neuronas y/o factores tróficos como el GDNF, el bFGF o la insulina para retenerla o restaurar dicha expresión, de modo de otorgarle nuevamente a las células de Müller una potencial función regeneradora de la retina. 7) El daño oxidativo induce la de-diferenciación y la proliferación de las células gliales, lo que apoya la hipótesis de su rol como células madre. Esto, sumado a los efectos neuroprotectores de estas células podría contribuir a mantener estable el número de neuronas y así preservar la funcionalidad de la retina.

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