MUTAGENESIS DIRIGIDA AL GEN DE LA DIHIDROFOLATO REDUCTASA TIMIDILATO SINTASA DE TRYPANOSOMA CRUZI: ENSAYOS DE VIRULENCIA E INMUNOGENICIDAD DE SUBLINEAS MUTANTES

Tesis

Resumen *

La inmunización con organismos vivos atenuados generalmente induce protección sin producir patología. De no conocerse el substrato genético de la atenuación, no se puede excluir una eventual reversión a un fenotipo virulento. En el presente trabajo de tesis doctoral informamos los resultados obtenidos en cuanto a la generación de una mutante atenuada de Trypanosoma cruzi para el gen dhfr-ts, capaz de inducir una inmunidad protectora frente a una infección virulenta. El gen codificante para el enzima dihidrofolato reductasa-timidilato sintetasa (DHFR-TS) es un gen de copia simple lo cual lo convierte en un blanco ideal para ensayos de mutagénesis dirigida mediante recombinación homóloga. Por otro lado la enzima DHFR-TS es importante en el metabolismo de parásitos protozoarios, debido a su rol central en el metabolismo celular y en la síntesis de ADN. La inhibición de la DHFR previene la biosíntesis de timidina, provocando de esta manera la muerte celular. Mediante el empleo y optimización de diferentes técnicas moleculares logramos la construcción de vectores de reemplazo con el fin de eliminar el gen dhfr-ts del genoma de T. cruzi por recombinación homóloga. La obtención de parásitos carentes de ambas copias alélicas de este gen no fue posible, muy probablemente debido a la esencialidad del mismo en el ciclo de vida de T. cruzi. Sin embargo, a través de los ensayos de manipulación genética de este organismo fuimos capaces de detectar cierta plasticidad en el genoma del mismo. La deleción de un solo alelo del gen dhfr-ts es suficiente para comprometer el crecimiento in vitro de estos parásitos mutantes. En ensayos in vivo también se observó un efecto en la virulencia e inmunogenicidad de estas mutantes, como fue demostrado por una menor carga parasitaria y un menor porcentaje de células CD8+ específicas para T. cruzi en modelos de infección en animales experimentales. Ensayos de vacunación a corto y largo plazo pusieron en evidencia la capacidad de estas mutantes atenuadas de inducir la generación de una inmunidad protectiva en animales inmunizados y conferir protección frente a infección virulenta. Interesante también es la detección de una proporción de células T CD8+ específicas para T. cruzi presentando un fenotipo de memoria central en ratones con un año de inmunización. Información suministrada por el agente en SIGEVA