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Autoría
Fecha
01/01/2004
Resumen
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SIGEVA
El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es una citoquina que induce la proliferación y diferenciación de precursores mieloides, así como la liberación al torrente sanguíneo y la activación de las funciones de los neutrófilos maduros. Estas acciones se ejercen a través de la unión de la citoquina a moléculas receptoras presentes en células del linaje granulocítico. Asimismo, la expresión ...
El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es una citoquina que induce la proliferación y diferenciación de precursores mieloides, así como la liberación al torrente sanguíneo y la activación de las funciones de los neutrófilos maduros. Estas acciones se ejercen a través de la unión de la citoquina a moléculas receptoras presentes en células del linaje granulocítico. Asimismo, la expresión del receptor fue identificada en tejidos no hematopoyéticos, como células trofoblásticas, placenta humana y células endoteliales vasculares. Actualmente, la citoquina recombinante es utilizada para promover la recuperación medular después de transplantes de médula ósea o de quimioterapia citotóxica. Desde el punto de vista estructural, el G-CSF es una glicoproteína de 174 aminoácidos que posee una glicosilación en la Thr 133. La identificación de los residuos de aminoácidos involucrados en la unión de la citoquina al receptor constituye un paso importante no sólo para entender las bases moleculares responsables de sus acciones biológicas, sino también para emprender la síntesis de agonistas peptídicos que puedan utilizarse con fines terapéuticos. Con el propósito de caracterizar las propiedades de la interacción G-CSF:receptor y delimitar los dominios de la citoquina que son críticos para la expresión de sus funciones biológicas, se utilizaron anticuerpos monoclonales (mAbs) obtenidos por inmunización de ratones BALB/c con G-CSF humano expresado en E.Coli (variante no glicosilada) o en células CHO (variante glicosilada). En primer lugar, se estudiaron las propiedades de los mAbs, y posteriormente se evaluó el efecto de los anticuerpos sobre la actividad del hG-CSF en dos sistemas que presentan receptores específicos para la citoquina, tales como placenta humana y células derivadas de una leucemia mieloide murina (línea celular NFS-60). De todos los anticuerpos anti-hG-CSF obtenidos, se seleccionaron los mAbs denominados 8C2 y 6E3, que reconocieron a la citoquina en su estado nativo. Estos anticuerpos reaccionaron en forma similar con el hG-CSF glicosilado y no glicosilado, sugiriendo que los epitopes reconocidos por los mismos no incluirían el sitio de glicosilación localizado en la Thr 133. Por su parte, la incubación de los mAbs con el 125I-hG-CSF indicó que aunque el mAb 6E3 originó un complejo 1:1 formado por una molécula de anticuerpo y una de citoquina, el mAb 8C2 no se unió a la citoquina iodada, probablemente debido a una modificación directa o indirecta del epitope producida como consecuencia del proceso de marcación. Los ensayos de competición demostraron que los mAbs estaban dirigidos contra regiones independientes en la molécula de citoquina. La identificación de los epitopes reconocidos por los mAbs se realizó por digestión del hG-CSF con diferentes enzimas proteolíticas y análisis de la reactividad de los anticuerpos con los fragmentos peptídicos separados por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferidos a membranas de PVDF. Los resultados indicaron que la menor región delimitada por el mAb 8C2 se ubica entre los aminoácidos 41-58, mientras que el mAb 6E3 reconocería un epitope conformacional localizado entre los aminoácidos 1-22 y 94-122/123 de la citoquina. Para delimitar con mayor precisión la estructura de los epitopes reconocidos por los mAbs, se estudió la reactividad de los anticuerpos con 84 octapéptidos sintetizados en fase sólida, que representaron la secuencia completa del hG-CSF. La ausencia de unión del mAb 6E3 a los péptidos demostró la estricta dependencia de la conformación de su epitope. Por su parte, el mAb 8C2 reconoció la secuencia 39-52, relacionada con la región 41-58 propuesta por digestión proteolítica del hG-CSF, y otras dos zonas, que no habían sido detectadas previamente, ubicadas entre los aminoácidos 115-124 y 155-164. El análisis de la localización de estas regiones en la estructura terciaria del hG-CSF demostró que las secuencias 39-52 y 155-164 se encuentran espacialmente cercanas y constituirían un determinante antigénico conformacional. La reactividad del segmento 115-124, localizado en un dominio diferente, pudo ser explicada por homología de algunos de sus aminoácidos con residuos incluidos en el epitope conformacional. Con el propósito de evaluar la participación de los epitopes reconocidos por los mAbs en la activación de las funciones biológicas del hG-CSF, se estudió la interacción G-CSF:receptor en presencia de los anticuerpos. Los resultados obtenidos demostraron que el mAb 6E3 inhibió la unión de la citoquina a microsomas de placenta humana, sugiriendo que la zona reconocida por el mAb estaría cerca o incluida en el dominio de unión al receptor. Por su parte, el mAb 8C2 reconoció un epitope que quedaba expuesto luego de la unión de la citoquina a los receptores. Cuando se evaluó el efecto de los mAbs sobre las acciones biológicas del hG-CSF en las células NFS-60, se observó que tanto el mAb 6E3 como el mAb 8C2 inhibieron la actividad proliferativa de la citoquina. Sin embargo, sólo el mAb 6E3 desplazó la unión del hG-CSF biotinilado a los receptores celulares. Puesto que los resultados obtenidos indicaron que el mAb 8C2 reconoce un epitope involucrado en la expresión de la actividad proliferativa del hG-CSF, evaluamos la accesibilidad del epitope 8C2 en condiciones que activaran la respuesta biológica. Sobre la base de estas consideraciones, los ensayos de formación de complejos hG-CSF:receptor se realizaron a 37ºC en presencia de azida sódica para prevenir la internalización. El aumento de temperatura produjo el enmascaramiento del epitope 8C2, evidenciado por una disminución en la cantidad de sitios expuestos en la molécula de citoquina, probablemente debido a la participación de procesos de oligomerización de receptores. Cuando el hG-CSF se preincubó con el mAb 8C2 y luego se incubaron las células a 37ºC, no se detectó una disminución del número de epitopes expuestos, sugiriendo que el mAb bloqueaba la agregación de los complejos hG-CSF:receptor. En su conjunto, los resultados obtenidos permitieron proponer un modelo secuencial de acción del hG-CSF, en el que primero se produciría la unión de la citoquina a través del sitio delimitado por el mAb 6E3 (aminoácidos 1-22 y 94-122/123), quedando expuesta la región reconocida por el mAb 8C2 (aminoácidos 39-52 y 155-164). Posteriormente se desencadenaría la oligomerización de receptores que llevaría al ocultamiento del sitio reconocido por el mAb 8C2 y a la internalización de los complejos formados.
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Palabras Clave
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