Producción CyT
Biocell - Cromatografía de Afinidad: Desarrollo de una columna de afinidad para el aislamiento y purificación de Lisozima
Congreso
Autoría:
Ramos PD ; González UA ; Ferraris MPFecha:
2018Editorial y Lugar de Edición:
INST HISTOL EMBRIOL-CONICETISSN:
0327-9545Resumen *
El objetivo de este trabajo es la elaboración de una columna de afinidad de lecho fijo con el macroligando Célula-Cibacron Blue inmovilizado a geles sólidos para el aislamiento y purificación de Lisozima (Lis).Los macroligandos de afinidad se prepararon a partir de células de levadura modificadas por tratamiento químico con etanol y con la molécula de ligando Cibacron Blue F3GA inmovilizada a la pared celular por unión covalente. Se determinó la cantidad de ligando inmovilizado por método espectrofotométrico a 610nm. Se prepararon cubos de agarosa-macroligando por suspensión de 250 mg de macroligando Celula-Cibacron en agarosa al 4%, se dejó enfriar a temperatura ambiente en una película de 2 mm de espesor y finalmente se prepararon los cubos de 2x2x2 mm. Los experimentos de adsorción de Lis en el equilibrio fueron llevados a cabo en modo batch, el adsorbente fue caracterizado funcionalmente mediante determinación de la capacidad de adsorción (qm) y constante de afinidad (Kd) en el equilibrio a través de isotermas de adsorción (Langmuir). Para determinar el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio de Lis sobre el adsorbente, se realizó un estudio cinético de la adsorción; se tomó 1 ml de muestra a intervalos de 30 min y luego a intervalos de 2 horas, seguidamente se determinó la concentración de Lis por espectofotometría a 280nm. Se realizaron ensayos de aplicación del macroligando en columna cromatográfica para la separación de Lis a partir de la clara de huevo. Para ello se colocaron los cubos de agarosa-macroligando en una columna de vidrio de 16 mm de diámetro y de 20 cm de altura, la cantidad de agarosa-macroligando cubría ¾ partes de la columna. Finalmente se añadieron 15 ml de clara de huevo previamente homogeneizada. Se analizó el grado de recuperación y pureza de la proteína, para ello las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE. Finalmente se determinó la concentración de proteínas mediante espectrofotometría.Los resultados indican que el macroligando Célula-Cibacron posee una elevada capacidad de inmovilización del ligando (240 μmol de ligando / g de célula). Se realizó un estudio cuantitativo de la adsorción por afinidad de Lis a los cubos de agarosa-macroligando para caracterizar, mediante la determinación de parámetros cinéticos, la eficiencia del adsorbente obtenido. La adsorción en el equilibrio de Lis a los cubos de agarosa- macroligando fue descripta por el modelo de Langmuir y los valores de adsorción de qm= 88,5 mg /g de adsorbente y Kd = 6,18x 10-6 M se calcularon por transformación lineal de la ecuación. La adsorción de Lis es bastante rápida al comienzo y se logra el equilibrio a la hora de iniciado el proceso, en donde se llega a la saturación del adsorbente. Los resultados de purificación de Lis desde clara de huevo mostraron una significativa cantidad de Lis que es purificada con el sistema cromatográfico de afinidad y con elevada pureza (más del 90%). Usando este modelo, obtuvimos 190 mg de Lys / g de adsorbente. No hubo oclusión o bloqueo de la columna de afinidad durante el proceso de separación. Información suministrada por el agente en SIGEVAPalabras Clave
MACROLIGANDOAGAROSALISOZIMACIBACRON BLUE