Mecanismos reguladores del tráfico de N-caderina

Tesis

Resumen *

La N-caderina es una molécula que media la adhesión entre células. Se sintetiza en ribosomas asociados al retículo endoplasmático (RE) como una proteína precursora, con un prodominio que debe ser removido para formar una proteína madura con capacidad adhesiva. La remoción del prodominio ocurre por proteasas del grupo de las furinas durante el pasaje de la caderina por la red del trans-Golgi. Desde allí la N-caderina es transportada a la membrana plasmática para cumplir con su función en la adhesión celular. En una etapa temprana luego de la biosíntesis, el dominio citoplasmático del precursor de caderina se asocia con β-catenina y la catenina p120. Resultados de nuestro laboratorio muestran que la fosfatasa de tirosina PTP1B promueve el tráfico RE-Golgi del precursor de N-caderina y modula su unión a p120. Además, mutaciones en el precursor de N-caderina que impiden la unión a p120 también inhiben su pasaje del RE al Golgi. Estos resultados sugieren que p120 es importante para esta etapa del tráfico anterógrado del precursor. Los objetivos principales de la siguiente tesis fueron: 1) demostrar directamente que p120 es requerido para el procesamiento del precursor de N-caderina, 2) definir el compartimento intracelular en el cual p120 juega un rol crítico, 3) proveer evidencia de los mecanismos moleculares implicados. Para cumplir con estos objetivos fue crítico contar con una herramienta para detectar y aislar el precursor de N-caderina. Para ello empleamos construcciones que poseen el epitope de hemoaglutinina (HA) inserto en el prodominio N-terminal de la N-caderina-GFP (proHA-WT), N-caderina (proHA-WT2), y la mutante N-caderina-3A-YFP (proHA-3A). La construcción proHA-3A posee una sustitución de triple alanina en el dominio juxtamembrana de la N-caderina que inhibe la interacción con p120. En todos los casos la localización del precursor es intracelular y colocaliza con calnexina (marcador de RE) y con GalNacT (marcador de Golgi), y no se detecta en las uniones intercelulares. Experimentos de Western Blot muestran que el precursor proHA-3A se acumula aproximadamente 4 veces respecto del precursor proHA-WT. Análisis de digestión con endoglicosidasa H revelan que mientras ~50% del precursor proHA-WT es sensible al corte con la enzima, esta fracción supera el 90% en el precursor proHA-3A, confirmando un defecto en el tráfico RE-Golgi del precursor mutante que no puede unir p120. El requerimiento de p120 para promover el procesamiento del precursor fue analizado posteriormente en dos modelos: células HeLa inhibidas para la expresión de p120 por shRNAi, y en células SW48, las cuales no expresan cantidades detectables de p120. En ambos casos, el precursor de proHA-WT transfectado se acumula y la fracción de caderina madura disminuye respecto de los controles. La reconstitución de células SW48 con isoformas de p120 que difieren en la región N-terminal, p120-1A, p120-3A, y p120-4A promueve de manera similar el procesamiento del precursor y la acumulación de la especie madura de N-caderina. Estos resultados descartan un rol selectivo de isoformas y de la región reguladora N-terminal. La distribución del precursor de N-caderina en células HeLa control, analizada por microscopía de fluorescencia convencional y confocal, es predominantemente perinuclear, sugiriendo acumulación en el Golgi. En contraste, en células interferidas para p120, el precursor de N-caderina se distribuye en forma de puntos dispersos y también en un patrón reticular, sugiriendo una acumulación en el RE. Los análisis de colocalización, utilizando marcadores de distintos compartimentos de la vía secretora, como GalNacT (marcador de Golgi), calnexina (marcador de RE), ergic53 (marcador de compartimento intermedio entre RE y Golgi) y Rab11 (marcador de endosomas de reciclado), sugieren que en ausencia de p120 el precursor presenta defectos en su exportación del RE y su pasaje al Golgi. Los resultados de colocalización en células SW48 fueron consistentes con los obtenidos en células HeLa. Para investigar el mecanismo molecular dependiente de p120 que promueve el tráfico/procesamiento del precursor de N-caderina, examinamos la presencia del factor NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor), una ATPasa esencial en el transporte vesicular, en el complejo del precursor. Los estudios previos de nuestro laboratorio indicaban que la PTP1B formaba un complejo con NSF, sugiriendo la posibilidad que PTP1B, p120 y NSF puedan estar vinculados funcionalmente. En los complejos del precursor de N-caderina, obtenidos por inmunoprecipitación con anti-HA, se pudo detectar una fracción de NSF asociada. En los complejos de N-caderina madura, obtenidos por inmunoprecipitación con anti N-caderina, el NSF no fue detectado, aun cuando la cantidad de N-caderina madura es significativamente mayor que la del precursor. Estos datos sugieren que la asociación del NSF al precursor de N-caderina ocurre en etapas tempranas del tráfico. Interesantemente, la asociación del NSF al complejo del precursor de N-caderina fue reducida en el complejo del precursor proHA-3A, y en el de proHA-WT en células con p120 interferida, sugiriendo que la asociación del NSF depende de p120. Además, experimentos de co-inmunoprecipitación mostraron que NSF y p120 forman parte de un complejo proteico común. La expresión de una dominante negativa del NSF (NSF-E329Q) produce un efecto similar al observado en células deficientes en p120, o sea una acumulación del precursor respecto de la N-caderina madura, lo que demuestra que NSF es necesario para el procesamiento del precursor de N-caderina a su forma madura. Además, para promover el procesamiento/tráfico del precursor, NSF requiere de p120, ya que en células deficientes en p120 la sobreexpresión de NSF-WT por sí sola no promueve el tráfico. El análisis de microscopía revela que tanto en células deficientes en p120 (células SW48 y células HeLa con p120 inhibida por shRNAi), como en células que expresan la dominante negativa del NSF, N-caderina-GFP no se expresa en las uniones intercelulares. Esto remarca la importancia de p120 y NSF en la expresión de N-caderina madura en la superficie y en la formación de las uniones intercelulares. En el presente trabajo también consideramos analizar, por espectrometría de masas, el complejo de proteínas asociado al precursor de proHA-WT y proHA-3A. La comparación del patrón de bandas de los complejos proteicos aislados por inmunoprecipitación de proHA-WT y proHA-3A, reveló diferencias en proteínas de ~100 kDa y ~250 kDa, presentes en mayor cantidad en el complejo de proHA-WT. El análisis de espectrometría de masas en tándem (ms/ms) permitió identificar a las proteínas α-actinina 4 (104 kDa masa teórica), α2- y β-2-espectrina (282/272 kDa). Todas estas proteínas han sido involucradas en el tráfico celular. En base a los resultados obtenidos, concluimos que la catenina p120 regula el procesamiento y tráfico RE-Golgi del precursor de N-caderina, a través del reclutamiento del NSF al complejo del precursor de N-caderina. El posible vínculo de p120 en el reclutamiento de espectrinas y α-actinina al precursor representa una atractiva opción para futuros estudios. Nuestros resultados son importantes puesto que sugieren un mecanismo de control del tráfico anterógrado de la caderina, el cual podría regular la capacidad adhesiva de las células, con efectos interesantes de estudiar en diversos procesos biológicos. Información suministrada por el agente en SIGEVA