Biotransformación hepática y extrahepática de fármacos benzimidazoles en rumiantes

Producción CyT

Tesis

Autoría

VIRKEL, GUILLERMO LEON

Fecha

01/01/2001

Resumen Información suministrada por el agente en SIGEVA

Los seres vivos poseen mecanismos de protección que funcionan ante la exposición a una sustancia química exógena. Los procesos de biotransformación y eliminación comienzan a funcionar en el mismo momento en que el organismo entra en contacto con un xenobiótico. El hígado es el principal sitio donde se produce la biotransformación de fármacos y/o compuestos tóxicos. Sin embargo, existe actividad metabólica en otr... Los seres vivos poseen mecanismos de protección que funcionan ante la exposición a una sustancia química exógena. Los procesos de biotransformación y eliminación comienzan a funcionar en el mismo momento en que el organismo entra en contacto con un xenobiótico. El hígado es el principal sitio donde se produce la biotransformación de fármacos y/o compuestos tóxicos. Sin embargo, existe actividad metabólica en otros tejidos. Los sistemas enzimáticos que intervienen en el metabolismo oxidativo de endo y xenobióticos se denominan oxidasas de función mixta y se encuentran fundamentalmente en el retículo endoplásmico liso de las células. Los sistemas citocromo P450 y flavin monooxigenasa (FMO) son las oxidasas de función mixta más importantes y participan en la biotransformación de compuestos exógenos en diferentes tejidos de mamíferos. Por otra parte, en el medio ambiente del rumen e intestino predominan las condiciones de anaerobiosis y las reducciones e hidrólisis son las reacciones metabólicas más importantes. La participación de la microflora digestiva en el metabolismo gastrointestinal de xenobióticos ha sido claramente demostrada. Los antihelmínticos benzimidazoles (BZD) y pro-benzimidazoles (pro-BZD) sufren un intenso metabolismo en el organismo del animal tratado. Los benzimidazoles tioéteres (albendazole, fenbendazole) son biotransformados por el sistema de oxidasas microsomales de función mixta a nivel hepático. Así, fenbendazole (FBZ) y albendazole (ABZ) son oxidados en sus respectivos metabolitos activos - oxfendazole (OFZ) y albendazole sulfóxido (ABZSO) -. Estos metabolitos sulfóxidos poseen un comportamiento quiral. En consecuencia, dos enantiómeros son detectados en el plasma y diferentes tejidos de localización parasitaria. La pro-droga netobimin (NTB) es un antihelmíntico pro-BDZ de amplio espectro, que ejerce su actividad por bioconversión en ABZ en el tracto gastrointestinal, fundamentalmente en el rumen. Además, los metabolitos sulfóxidos son reducidos a sus respectivos tioéteres por acción de la microflora gastrointestinal. La presente Tesis Doctoral aporta información sobre aspectos relevantes de la biotransformación de xenobióticos en rumiantes (ovinos y bovinos). Los antihelmínticos BZD fueron seleccionados como modelo, debido a que experimentan un intenso metabolismo oxidativo (tioéteres) y reductivo (sulfóxidos) en estas especies. El objetivo general de esta Tesis incluyó: a) caracterizar el patrón de biotransformación ruminal de netobimin, albendazole sulfóxido y oxfendazole, b) evaluar la sulforeducción enantioselectiva de los enantiómeros de albendazole sulfóxido y oxfendazole por fluido ruminal obtenido de ovinos y bovinos, c) estudiar la biotransformación microsomal hepática de albendazole y fenbendazole en ovinos y bovinos, d) caracterizar la sulfoxidación microsomal extrahepática (pulmonar e intestinal) de estas drogas antihelmínticas, e) investigar el comportamiento enantioselectivo del metabolismo hepático y extrahepático de albendazole y fenbendazole en bovinos y ovinos, f) caracterizar la influencia de las modificaciones en la flora digestiva sobre el metabolismo ruminal de estos fármacos y, g) estudiar el efecto de la restricción nutricional sobre la biotransformación hepática de albendazole. El patrón de biotransformación in vitro de NTB y ABZSO fue estudiado utilizando fluido ruminal obtenido de ovinos alimentados con diferentes dietas. El fluido ruminal fue obtenido de ovinos alimentados con heno (alfalfa/trébol rojo), alimento concentrado comercial o grano (maíz molido/avena). Las muestras de fluido ruminal fueron incubadas durante 5-360 min en anaerobiosis. La formación de ABZ fue mayor (entre 85.1 y 100 % del total de productos formados) cuando NTB fue incubado con fluido ruminal de ovinos alimentados con concentrado o grano, con respecto a la observada cuando la dieta fue a base de heno (entre 66.7 y 74.2 % sobre el total de productos formados). Una mayor capacidad de sulforeducción de ABZSO fue observada en el fluido ruminal obtenido de ovinos alimentados a base de concentrado o grano. Diferentes tipos de dieta originan cambios sobre la composición de la microflora ruminal, modificando a su vez la actividad metabólica a nivel del rumen. Las modificaciones en el patrón de biotransformación de NTB y ABZSO, ocasionadas por las diferentes dietas (heno, concentrado o grano), podrían alterar el comportamiento farmacocinético y el efecto farmacológico de estos antihelmínticos. El efecto del antibiótico ionóforo monensina, sobre la biotransformación de NTB y ABZSO por fluido ruminal ovino, también fue estudiado. Se demostró que la capacidad de biotransformación in vitro del fluido ruminal ovino es afectada por el tratamiento previo (durante 24 h) con el ionóforo, disminuyendo la tasa de formación de ABZ luego de incubar la pro-droga NTB (bioactivación) o ABZSO (sulforeducción). Monensina inhibe el crecimiento de bacterias Gram-positivas a nivel ruminal. Debido a esto, las alteraciones observadas en el patrón de biotransformación de NTB y ABZSO, podrían ser consecuencia del efecto inhibitorio del ionóforo sobre el crecimiento de estas poblaciones de bacterias ruminales. La menor formación de ABZ observada en presencia de monensina, podría tener un impacto negativo sobre la disponibilidad de esta droga antihelmíntica en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, sobre la eficacia clínica sobre nematodes gastrointestinales. El metabolismo ruminal de ABZSO y OFZ fue estudiado en forma comparativa por primera vez. No se observaron diferencias al comparar las tasas de sulforeducción de ABZSO y OFZ y las concentraciones de sus productos metabólicos (ABZ y FBZ) formados luego de incubar ambos sustratos con fluido ruminal bovino. De igual forma, no hubo diferencias al comparar la reducción de OFZ y las concentraciones de FBZ obtenidas in vitro en el fluido ruminal de ambas especies. También, los enantiómeros (+) y (-) de ABZSO fueron purificados y utilizados individualmente como sustratos. Así, la sulforeducción de ambos enantiómeros fue estudiada en forma comparativa en fluido ruminal obtenido de ovinos y bovinos. La reducción in vitro de ABZSO por fluido ruminal de ambas especies fue enantioselectiva. En fluido ruminal bovino, las concentraciones de ABZ fueron mayores (entre 55 y 158 %) luego de incubar (+) ABZSO, en relación a las observadas cuando el enantiómero (-) ABZSO fue el sustrato incubado. Algo similar ocurrió luego de incubar ambos enantiómeros individualmente con fluido ruminal ovino. Mayores tasas de formación de ABZ fueron observadas luego de incubar (+) ABZSO con fluido ruminal de ambas especies, coincidiendo con las mayores tasas de desaparición de este enantiómero con respecto a su isómero (-) ABZSO. La detección de (-) ABZSO a partir de su antípoda - (+) ABZSO - y de (+) ABZSO luego de incubar (-) ABZSO, indicaría la existencia de inversión quiral para estas moléculas a nivel del rumen. El perfil metabólico de ambos enantiómeros de OFZ fue similar al observado para los enantiómeros de ABZSO. Estas características del metabolismo ruminal de los BZD sulfóxidos podrían ser relevantes para la actividad y duración del efecto antihelmíntico de estas moléculas. La sulfoxidación enantioselectiva de ABZ y FBZ fue caracterizada en microsomas hepáticos, pulmonares e intestinales de ovinos y bovinos. En microsomas hepáticos, la sulfoxidación de ABZ resultó entre 2.5 (ovinos) y 7.7 (bovinos) veces mayor (P<0.001) comparada a la de FBZ. Mayores tasas de sulfoxidación fueron también observadas para ABZ (en comparación con FBZ) en microsomas pulmonares e intestinales. En ambas especies, una mayor capacidad para oxidar ambos tioéteres fue observada en microsomas hepáticos, en comparación con microsomas pulmonares e intestinales. En los tres tejidos estudiados, la sulfoxidación microsomal originó los dos enantiómeros - (+) y (-) - de ABZSO y OFZ. Se observaron diferentes proporciones enantioméricas, lo cual indica que la sulfoxidación es enantioselectiva. Por ejemplo, la proporción enantiomérica (+) ABZSO/(-) ABZSO en microsomas hepáticos de ovinos fue 79.5/20.5 y la observada en microsomas hepáticos de bovinos fue 72.6/27.4. El enantiómero (+) OFZ también fue recuperado en mayor proporción (~ 75 %) luego de incubar FBZ con microsomas hepáticos de ambas especies. De la misma forma, los enantiómeros (+) ABZSO y (+) OFZ fueron los principales productos metabólicos formados por microsomas obtenidos de la mucosa intestinal. Sin embargo, se observaron diferentes proporciones enantioméricas luego de incubar ABZ y FBZ con microsomas pulmonares de ambas especies. Incubaciones de ABZ en presencia de metimazole (MTZ) (inhibidor competitivo del sistema FMO), permitieron estimar la participación de ambas oxidasas de función mixta (FMO y citocromo P450) en la sulfoxidación de ABZ y FBZ. En microsomas hepáticos, la formación de los enantiómeros (+) ABZSO y (+) OFZ se produce principalmente por acción del sistema enzimático FMO, mientras que citocromo P450 participa fundamentalmente en la producción del isómero (-) de ambas moléculas. Algo similar ocurre en la mucosa intestinal, donde las proporciones enantioméricas fueron similares a las observadas en microsomas hepáticos. Por el contrario, no se observó inhibición de la sulfoxidación luego de incubar ABZ en presencia de MTZ con microsomas pulmonares obtenidos de ovinos y bovinos. Esto sugiere que el sistema FMO no es la principal ruta metabólica para la formación de ABZSO en el parénquima pulmonar. Si bien el hígado es el principal sitio donde se produce la oxidación de los BZD tioéteres, estos resultados muestran la importancia de la actividad metabólica en el parénquima pulmonar y en la mucosa intestinal, independientemente de la vía metabólica involucrada. Así, la sulfoxidación extrahepática (pulmonar e intestinal) de ABZ y FBZ podría contribuir al efecto de primer pasaje que sufren estas drogas cuando son administradas por vía enteral en ovinos y bovinos. También se evaluó el efecto de la restricción nutricional sobre el el metabolismo microsomal hepático en bovinos, utilizando ABZ como molécula modelo. Un estado nutricional pobre es análogo al que se observa en animales parasitados. La restricción nutricional inducida experimentalmente fue corroborada por el aumento de los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres y b-hidroxi-butirato (cuerpo cetónico). Se determinaron la velocidad máxima (Vmax) y el valor de Km de la reacción de sulfoxidación luego de incubar ABZ con microsomas hepáticos obtenidos de bovinos alimentados ad libitum o sometidos a restricción nutricional. Mientras que no se observaron modificaciones en los valores de Vmax, mayores valores de Km para la formación total de ABZSO y del enantiómero (+) ABZSO fueron obtenidos en los microsomas hepáticos de animales restringidos con respecto a los controles. Debido a que (+) ABZSO se forma por acción del sistema FMO, los mayores valores de Km indican una menor afinidad de esta enzima por el sustrato (ABZ) y por ende una unión más débil de éste al sitio catalítico. Los menores valores de Clint (Vmax/Km) para la formación total de ABZSO y del enantiómero (+) ABZSO, confirman la menor capacidad del hígado para depurar ABZ por el sistema FMO en los animales sometidos a restricción nutricional. Estos resultados se correlacionan con las modificaciones en el comportamiento farmacocinético de ABZSO observadas en bovinos en estudios previos realizados en nuestro laboratorio. En conclusión, los resultados presentados en esta Tesis Doctoral, constituyen un aporte significativo al conocimiento de los procesos metabólicos implicados en la eliminación de xenobióticos en rumiantes, lo cual tiene gran trascendencia dentro de la Farmacología Veterinaria. Si bien estos estudios se realizaron utilizando a los antihelmínticos BZD como modelo, las vías metabólicas descriptas podrían estar involucradas en la biotransformación de otros fármacos o compuestos tóxicos de interés en Medicina Veterinaria. Existe una relación estrecha entre el patrón de biotransformación de los BZD y la permanencia de éstos fármacos o de sus productos metabólicos en el organismo. Desde este punto de vista, los resultados presentados contribuyen a optimizar la eficacia antihelmíntica, debido a que el conocimiento generado aporta a la comprensión del comportamiento farmacocinético de estas drogas y de los factores que pueden modificarlo.

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Palabras Clave

metabolismo hepáticorumiantesbenzimidazolesmetabolismo extra-hepático