Aislamiento y caracterización de una metaloproteinasas del veneno de Botrhops alternatus del nordeste argentino. Estudio de su fragmento de autólisis.

Tesis

Resumen *

El registro de accidentes ofídicos en Argentina es de 850 casos anuales, siendo en su gran mayoría producidas por el género Bothrops (97%). El veneno botrópico posee efectos proteolítico, coagulante y hemorrágico. La característica de la intoxicación es el prominente daño tisular local en el sitio de la mordedura, el cual se desarrolla rápidamente luego del accidente, y puede resultar en secuelas permanentes. En envenenamientos moderados a severos, las alteraciones patológicas a nivel local se incrementan y son acompañadas por una serie de efectos sistémicos: hemorragia, coagulopatía de consumo, shock hipovolémico y fallo renal agudo. Los venenos de serpientes son una rica y compleja fuente de proteínas (más del 90% del peso seco), componentes orgánicos e inorgánicos. Entre las proteínas asociadas a la intoxicación se incluyen enzimas: metaloproteinasas, fosfolipasas, serinoproteinasas y aminoácido oxidasas. Las metaloproteinasas de venenos de serpientes (SVMPs: Snake Venom Metalloproteinases) comprenden una serie de proteinasas zinc-dependientes con importante actividad proteolítica sobre diversos sustratos y responsables del efecto hemorrágico, además, alteran el sistema hemostático e inhiben la agregación plaquetaria. En los últimos años estas enzimas, no sólo han llamado la atención por su rol clave en la fisiopatología del accidente ofídico sino también por sus potenciales usos en el campo de la farmacología experimental. Por esta razón, el objetivo del presente trabajo de tesis fue el aislamiento y caracterización de una toxina hemorrágica a partir del veneno de B. alternatus, género de importancia médico-sanitaria en la Argentina, y particularmente en la región Nordeste. Se purificó una metaloproteinasa (denominada baltergina) de 50.962 Da mediante dos procedimientos cromatográficos (intercambio aniónico y filtración por gel). La digestión tríptica de la proteína seguida de secuenciación permitió el alineamiento con secuencias de otras metaloproteinasas y se la pudo clasificar como una SVMP de clase P-III. Se evaluaron sus actividades tanto en ensayos in vitro como en animales de experimentación. Presentó actividad caseinolítica (18,72 Unidades/mg de proteína) hidrolizando principalmente la Fracción β-CN y se demostró que, los iones Ca2+ y Mg2+ incrementaron dicha actividad mientras que, el Zn2+ y el Hg2+ la inhibieron. Además mostró actividad α-fibrinogenolítica y α-fibrinolítica y provocó la disolución del coágulo de fibrina (CFM= 4,29 mg/mL). Degradó gelatina e hidrolizó las principales cadenas del colágeno tipo IV, componente mayoritario de la membrana basal del endotelio capilar. Baltergina fue capaz de inhibir significativamente la adhesión de células C2C12 a proteínas ligando presentes en SFB (9,1 µM de proteína provocaron sólo un 32% de adherencia) y, mediante el ensayo de citotoxicidad, se observó una reducción en su viabilidad (47% de viabilidad celular luego de la exposición a 9,1 µM de proteína) además, las células expuestas mostraron cambios compatibles con apoptosis (por MEB). Presentó actividad hemorrágica local (DHM= 1,9 µg), edematizante (DEM= 1,3 µg), miotóxica local (su máxima expresión se evidenció a las 6 h post-inyección), hemorrágica sistémica (DHPM= 10 µg) actuando directamente sobre la pared de los capilares sanguíneos (demostrado por MET), y letal (DL50 i.p.= 10,32 μg/g, DL50 i.v.= 6,00 μg/g) siendo esta última una dosis de 3 a 5 veces mayor que la del veneno entero. Asimismo, se demostró que induce alteraciones patológicas sistémicas en órganos vitales de animales de experimentación (por vía i.v.), debido a la hemorragia producida y la hipoxia tisular secundaria a la hipovolemia. A través de estudios de inhibición se observó que varias de tales actividades son inhibidas por quelantes de metales, confirmando su naturaleza metal-dependiente. Por otro lado, no presentó actividad coagulante, procoagulante ni desfibrinante. Además, mediante la obtención de suero específico anti-baltergina (en conejos) se comprobó su efectividad para neutralizar completamente la actividad proteolítica, hemorrágica y miotóxica del veneno de B. alternatus, indicando el rol clave que juegan las metaloproteinasas en la toxicidad local asociada al envenenamiento botrópico. Por último, se demostró la capacidad autolítica de baltergina y se obtuvo un fragmento de 28 kDa -vinculado a moléculas de tipo desintegrina- capaz de inhibir la adhesión celular in vitro, lo que permitió su inclusión dentro de la subclase P-IIIb de las SVMPs. En conclusión, se demuestra que baltergina contribuye marcadamente a la toxicidad local y sistémica del envenenamiento por B. alternatus, muy probablemente actuando de modo sinérgico con otros componentes del veneno. Es capaz de autolizarse produciendo un fragmento estable con actividad desintegrina, lo que lo convierte en una valiosa herramienta biológica para estudios de adhesión celular, así como también, un modelo para el desarrollo de nuevas drogas anti-metastásicas. El suero específico anti-baltergina es efectivo en la neutralización de las actividades locales del veneno entero y reduce la extensión global del daño tisular, impidiendo la acción de los otros componentes presentes en el mismo. Estos resultados sientan base sobre la posibilidad de preparar nuevas formulaciones dirigidas a la terapia antiofídica a partir de anticuerpos contra toxinas específicas, principales responsables de la toxicidad del veneno. Información suministrada por el agente en SIGEVA