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Autoría
Fecha
01/01/2014
Resumen
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La eritropoyetina (EPO) es una glicoproteína perteneciente a las citoquinas de tipo I que se caracteriza por su funcionalidad pleiotrópica. El rol biológico principal de esta hormona está relacionado con la estimulación de glóbulos rojos en la médula ósea y el mantenimiento de la homeostasis sanguínea, por lo que históricamente se ha utilizado para el tratamiento de pacientes con anemia derivada de insuficiencia renal cr&oacu...
La eritropoyetina (EPO) es una glicoproteína perteneciente a las citoquinas de tipo I que se caracteriza por su funcionalidad pleiotrópica. El rol biológico principal de esta hormona está relacionado con la estimulación de glóbulos rojos en la médula ósea y el mantenimiento de la homeostasis sanguínea, por lo que históricamente se ha utilizado para el tratamiento de pacientes con anemia derivada de insuficiencia renal crónica. Sin embargo, con el hallazgo de la expresión de la EPO y su receptor en otros tejidos no hematopoyéticos, se planteó un nuevo rol de esta molécula, fundamentalmente como una citoquina protectora de tejidos, principalmente en el cerebro. En este tejido ha evidenciado un rol antiapopotótico y neuroprotector por lo que ha sido propuesta para tratar anomalías del sistema nervioso central (SNC). No obstante, su utilización para el tratamiento de estas patologías puede conllevar a la aparición de efectos adversos asociados a su actividad eritropoyética, tales como elevación de la masa de glóbulos rojos, hipertensión y fenómenos protrombóticos. En el presente trabajo de tesis se desarrolló un proceso de purificación alternativo de la hormona producida en células CHO.k1 (rhEPO) para obtener una combinación de glicoformas de EPO que se denominó Neuroepoetin (rhNEPO), la cual presentó una composición de isoformas menos ácidas (rango pI 4.2-6.1) y menor contenido de ácido siálico (8,0 ± 1,0 mol/mol de proteína). Así como también demostró mayor contenido de estructuras neutras, mono-, di- y tri-sialidadas con respecto a las existentes en la rhEPO (en total 81,4% y 30%, respectivamente) y, por lo tanto, menor porcentaje de oligosacáridos tetrasialidados (13,6%) con respecto a rhEPO (58,1%). Además, la rhNEPO presentó 45,6% más estructuras de oligosacáridos neutros menos ramificadas (di- y tri-antenarias). Estas características se tradujeron en una actividad eritropoyética in vivo prácticamente nula, siendo sólo del 4% con respecto a la hormona hematopoyética. A pesar de esto, no se detectaron cambios en su afinidad por el receptor en ensayos in vitro en células UT-7/EPO (1,25 ± 0,60 x 1011 l.mol-1 y 1,30 ± 0,63 x 1011 l.mol-1), pero sí con la línea celular TF-1, donde la nueva combinación presentó una mayor afinidad por el receptor con respecto a rhEPO (4,82 ± 0,64 x 1010 l.mol-1 y 2,93 ± 0,15 x 1010 l.mol-1, respectivamente). La caracterización farmacocinética plasmática se realizó empleando diferentes vías de administración: endovenosa y extravasculares (subcutánea e intraperitoneal). Como era esperable, las diferencias observadas en el perfil de glicosilación de la rhNEPO incrementaron su depuración plasmática en 9,5 veces para la vía endovenosa y en 12,8 y 18,3 veces para las vías extravasculares, respectivamente. La capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica fue analizada mediante la evaluación de la farmacocinética de las variantes de rhEPO en el LCR empleando las vías de administración endovenosa e intraperitoneal. La rhNEPO fue capaz de ingresar al líquido cefalorraquídeo más rápidamente que su contraparte hematopoyética en concentraciones dentro del rango de citoprotección utilizando ambas vías de inoculación, siendo la máxima concentración alcanzada en LCR del 0,1 al 0,6 % de la máxima concentración plasmática, no existiendo diferencias entre rhNEPO y rhEPO. Con el fin de incrementar el pasaje de estas moléculas, se evaluó la apertura osmótica de la BHE utilizando una solución hiperosmolar de manitol y se observó que si bien este porcentaje de transferencia se mantuvo prácticamente constante, la rhNEPO alcanzó una concentración máxima 1,6 veces superior a la observada en ausencia de este polialcohol. Por su parte, la rhEPO no alcanzó mayores concentraciones sino que el uso de manitol permitió anticipar su ingreso al SNC, detectándose a los 5 min post-inyección en comparación con los 30 min que debieron transcurrir para detectarla cuando fue administrada en ausencia del mismo. La acción neuroprotectora de esta nueva combinación fue evaluada in vitro en células SH-SY5Y (indiferenciadas y diferenciadas) y PC-12 (diferenciadas a fenotipo neuronal con NGF) sometidas a distintos estímulos apoptóticos. En los ensayos de proliferación con células SH-SY5Y en estado proliferativo, la rhNEPO fue capaz de preservar la viabilidad celular a menor concentración que la rhEPO luego de someter las células a la neurotoxina 6-OHDA. Este mismo comportamiento fue observado luego de inducir apoptosis a las células PC-12 diferenciadas mediante supresión de suero y factor de crecimiento nervioso. En cambio, en las células SH-SY5Y sometidas a diferenciación y apoptosis mediante incubación con STP, ambas variantes mostraron efecto protector de la supervivencia celular similar. El rol antiapoptótico de la Neuroepoetin fue evaluado in vitro empleando líneas celulares estableciadas (SH-SY5Y indiferenciadas y PC-12 diferenciadas) así como cultivo primario de neuronas corticales de rata. En las células SH-SY5Y expuestas al estímulo apoptótico 6-OHDA, la rhNEPO fue capaz de reducir el porcentaje de células apoptóticas a una menor concentración con respecto a rhEPO. Sin embargo, en la línea celular PC-12 y en el cultivo primario de neuronas corticales de rata, a la misma concentración la rhNEPO fue más efectiva para disminuir la apoptosis. En prácticamente todos los casos la rhNEPO disminuyó la apoptosis entre 40 y 60% con respecto al control de muerte. Finalmente, la actividad neuroprotectora fue evaluada in vivo empleando un modelo de isquemia cerebral focal mediante oclusión de la arteria cerebral media en ratones Balb/c. En esta oportunidad, ambas variantes de rhEPO permitieron una recuperación del estado neurológico de los animales luego del daño ocasionado por la oclusión de dicha arteria. Asimismo, se observó que ambas variantes tendieron a disminuir el volumen de infarto del tejido cerebral entre 35% y 42%. A nivel morfológico, en la región CA1 del hipocampo, se preservó la respuesta astroglial luego de los tratamientos con rhEPO o rhNEPO, mientras que la expresión de MAP2 y NF 200 se incrementó con respecto a los animales tratados sólo con el vehículo. Estos resultados indicarían que los tratamientos con rhEPO y rhNEPO no sólo permiten una disminución de la respuesta inflamatoria ocasionada por la MCAO en dicha región sino también favorecen la recuperación de la arborización dendrítica y la preservación de la estructura neuronal. En resumen, este trabajo de tesis permitió obtener una nueva combinación de isoformas de rhEPO que mantuvo o mejoró las propiedades neuroprotectoras y antiapoptóticas de la rhEPO, lo cual se manifestó tanto en ensayos in vitro como in vivo y, al mismo tiempo, presentó prácticamente nula actividad hematopoyética in vivo, postulando a la rhNEPO como un potencial candidato terapéutico para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central.
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ERITROPOYETINAPURIFICACIÓNCONTENIDO DE ÁCIDO SIÁLICONEUROPROTECCIÓN