La glucólisis y la partición de fotoasimilados en plantas: estudio molecular de la regulación redox de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa fosforilante citosólica

Tesis

Resumen *

En plantas la glucólisis presenta algunas características únicas. Por un lado la vía se encuentra duplicada y compartimentada entre el plástido y el citosol. Por otra parte, dado que la Suc en vegetales es el azúcar principalmente transportado y la forma en que el carbono ingresa a los tejidos no fotosintéticos, es la Suc y no la Glc el sustrato inicial de la vía. Asimismo, los productos finales incluyen, además de piruvato, otros ácidos orgánicos como por ejemplo el malato. Por último, aunque la glucólisis en el citosol de las células vegetales puede ocurrir mediante la secuencia de reacciones de la glucólisis clásica, estas células presentan también rutas alternativas en varios de sus intermediarios y la regulación de las enzimas involucradas difiere de cómo se da en otros organismos. La vía glucolítica citosólica es, a su vez, una red compleja que presenta reacciones enzimáticas paralelas a nivel del metabolismo de algunos de sus intermediarios como la Suc, la Fru6P, el Ga3P y el PEP. Estas alternativas proporcionan a la planta opciones metabólicas que facilitan su desarrollo y adaptación ante distintos tipos de estrés medioambientales como por ejemplo anoxia o falta de Pi . El Ga3P puede ser metabolizado por dos enzimas distintas en el citosol de las células vegetales. Mediante la vía clásica, la Ga3PDHasa dependiente de NAD+ convierte de forma reversible el Ga3P en 1,3bisPGA usando Pi y generando NADH. El 1,3bisPGA así producido es utilizado por la PGKasa para producir 3PGA y una molécula de ATP. Alternativamente, el Ga3P puede ser convertido directamente en 3PGA mediante una reacción de hidrólisis irreversible catalizada por la Ga3P deshidrogenasa no fosforilante dependiente de NADP+ (np-Ga3PDHasa, EC 1.2.1.9) que genera NADPH en lugar de NADH y que no produce ATP (Iglesias 2008). Este paso alternativo presente en plantas resulta muy importante ya que, en los períodos de luz, las triosas-P obtenidas de la actividad fotosintética pueden ser exportadas desde el cloroplasto al citosol para ser utilizadas por la Ga3PDHasa y la PGKasa (para generar energía) o por la np Ga3PDHasa, (generando poder reductor). En plantas, los estudios realizados con la Ga3PDHasa han demostrado que la enzima puede ser inactivada oxidación con H2O2, GSSG y GSNO, dicha perdida de actividad también puede ser revertida por reductores como el DTT o GSH. Además, se ha descrito que las dos isoformas de la enzima de Arabidopsis thaliana se inactivan por glutationilación o nitrosilación, recuperándose la actividad luego del tratamiento con DTT (Holtgrefe 2008). En estudios recientes donde se ha mutado el residuo de Cys esencial de la enzima de Arabidopsis (Cys155) se propone que la oxidación de la enzima por H2O2 ocurre por oxidación de un único residuo de Cys a sus formas de ácido sulfénico, ácido sulfínico y ácido sulfónico ya que la oxidación puede evitarse exponiendo previamente a la enzima a GSH. La enzima glutationilada puede recuperar completamente su actividad mediante glutarredoxina, o menos eficientemente con TRX-h . Recientemente, en nuestro grupo de trabajo se ha avanzado en la caracterización de la regulación de la Ga3PDHasa de trigo (Triticum aestivum, Tae) por agentes relacionados con las especies reactivas del oxígeno (ROS) y del nitrógeno (RNS). Estos compuestos causan modificaciones en la enzima que conducen a la pérdida de su actividad enzimática tal como se había mostrado anteriormente para la enzima de otras especies vegetales. Además, se observó que la oxidación puede ser revertida por TRX-h o glutarredoxinas (cuando la oxidación es producida por GSSG) y que la recuperación de la actividad es dependiente de la concentración del agente oxidante y del tiempo de exposición de la enzima a este agente . La caracterización cinética de la oxidación de la Ga3PDHasa de trigo con distintos compuestos oxidantes aportó información valiosa, poniendo de manifiesto la alta sensibilidad de la Ga3PDHasa al H2O2, marcadamente diferente a lo obtenido con ∙NO (SNP) y GSSG, cuyas velocidades de inactivación fueron 26 y 700 veces menor respectivamente. Además, en nuestro grupo de trabajo hemos demostrado que la oxidación de la enzima puede revertirse con TRX h de trigo dependiendo del grado de oxidación de la enzima. En función de nuestros resultados planteamos como hipótesis que la regulación podría ocurrir de dos formas, mediante la oxidación de la Cys catalítica a sus respectivos ácidos, o mediante la formación de un puente disulfuro intramolecular. También observamos que la oxidación prolongada del residuo catalítico llevaría a la oxidación del tiol a ácido sulfénico, sulfínico y sulfónico, siendo los dos últimos estados de oxidación irreversibles in vivo. En cambio, la formación del puente disulfuro intramolecular puede ser reducido restableciendo la actividad enzimática. Sin embargo, hasta el momento no existe evidencia ni antecedentes que logren discernir el mecanismo exacto por el que cursa en la inactivación por oxidación de la enzima. Con el sistema recombinante empleado se lograron expresar en E. coli la Ga3PDHasaWT de trigo y las cuatro versiones mutantes de la enzima en cada uno de los residuos de Cys que posee la proteína (Cys81, Cys135, Cys154 y Cys158) los cuales fueron reemplazados por Ser. Las diferentes versiones de la enzima recombinante se pudieron purificar por cromatografía IMAC, lográndose buenos rendimientos y un alto grado de pureza. Mediante la caracterización cinética de cada versión de la Ga3PDHasa pudimos determinar los valores de los parámetros cinéticos para cada una de ellas. Esto nos permitió concluir que el residuo de Cys154 es el residuo involucrado directamente en la catálisis (tal como se había informado para la enzima de otros organismos). Además, pudimos observar que el residuo de Cys158 influiría indirectamente en el entorno catalítico y que los residuos de Cys81 y 135, afectan indirectamente las propiedades cinéticas de la enzima. Los ensayos de oxidación con H2O2, pusieron de manifiesto que el residuo de Cys involucrado directamente en la oxidación de la enzima es la Cys154, ya que en su ausencia la oxidación no ocurre. Sin embargo se observó también que la eliminación del residuo de Cys158 favorece aún más la oxidación de la proteína, probablemente al dejar más expuesto el residuo de Cys154. Además, los ensayos de sobreoxidación mostraron que la Ga3PDHasaWT precipita al sobreoxidarse (al igual que las mutantes en los residuos de Cys81, 135 y 158) y que al faltar el residuo de Cys154 la proteína no se oxida y entonces no precipita. Sin embargo, en concordancia con los ensayos anteriores, se observó que al eliminar el residuo de Cys158, se favorece la sobreoxidación y precipitación de la Ga3PDHasa. Por último, se pudo mostrar que la sobreoxidación de la proteína genera la formación de agregados proteicos, los cuales serían responsables de la precipitación de la misma. En cuanto a la agregación de las versiones mutantes de la enzima, solo en ausencia del residuo de Cys154 no se observó este fenómeno, lo cual muestra la participación directa de este residuo en la agregación de la enzima. Nuevamente, la ausencia del residuo de Cys158 favoreció la sobreoxidación y agregación de la proteína. La determinación de los espectros de fluorescencia de cada versión de la enzima, mostró que las mutaciones generan algún tipo de modificación estructural que hace variar la intensidad de fluorescencia intrínseca de la molécula. Esto podría explicar las diferencias en las propiedades cinéticas de las mutantes de la enzima que no involucran directamente el residuo de Cys catalítico. Los resultados obtenidos nos permitieron avanzar en la caracterización molecular del mecanismo de oxidación de la Ga3PDHasa de trigo, pudiendo identificar el residuo de Cys involucrado en dicho mecanismo y la influencia de las otras tres Cys presentes en la molécula. Las herramientas moleculares desarrolladas, nos permitirán continuar con la caracterización molecular del mecanismo de regulación redox a fin de intentar discernir si la oxidación de la enzima puede ocurrir por formación de un puente disulfuro intracatenario Cys154?S-S-Cys158, la oxidación de la Cys154 a sus distintos ácidos, o ambos. Los resultados obtenidos en el presente trabajo, sumados a los obtenidos para la np Ga3PDHasa de trigo en nuestro laboratorio, nos permitirán comprender como es el mecanismo molecular por el cual las células vegetales regulan la partición del Ga3P citosólico ante diferentes estados redox. Además, y en función de lo hallado en animales para la Ga3PDHasa, se abren numerosos interrogantes sobre otras funciones no relacionadas a su actividad como enzima que podría tener la Ga3PDHasa en plantas. Los datos recolectados hasta el presente nos alientan a plantear como hipótesis que podría tener funciones tales como la de sensar el estado redox celular y/o participar como molécula transductora de la señal. Actualmente, en nuestro grupo de trabajo continuamos con el estudio molecular in vitro de la regulación redox de las Ga3PDHasas y estamos comenzando a realizar estudios in vivo en colaboración con otros laboratorios de nuestro Instituto que nos permitan abordar estas hipótesis.   Información suministrada por el agente en SIGEVA