Caracterización de antígenos de Yersinia enterocolitica asociados a artritis

Tesis

Resumen *

INTRODUCCION: Infecciones gastrointestinales por bacterias entéricas tales como Yersinia, Salmonella y Shigella están asociadas con artritis reactiva (ARe), una artropatía que pertenece al grupo de las espondiloartropatías (SpA). Además, algunas bacterias han sido especulativamente asociadas con la patogénesis de la artritis reumatoidea (AR). Cada una de estas formas de artritis se diferencia de la artritis séptica en que la bacteria no puede ser cultivada de las articulaciones afectadas. Sin embargo, antígenos bacterianos y en algunos casos DNA y/o RNA bacteriano han sido identificados en sinovia o líquido sinovial (LS) de estos pacientes. Sin embargo, el rol de los antígenos de Yersinia en el desarrollo de ARe no ha sido completamente dilucidado. Como bacterias asociadas a ARe frecuentemente causan diarrea en países de América Latina, es posible que numerosas artropatías que afectan a nuestra población sean el resultado de infecciones recurrentes por estas bacterias. Hasta el momento, estudios regionales que correlacionen artropatías con infecciones bacterianas no han sido realizados. Se ha demostrado que fibroblastos sinoviales juegan un rol esencial en la persistencia de la inflamación articular y que pueden actuar como intermediarios entre la infección con organismos artritogénicos y la osteoclastogénesis, a través de la expresión de RANKL (receptor activator of NF-kB ligand). Por otro lado, se ha demostrado que receptores Toll-like (TLR), se expresan en fibroblastos sinoviales induciendo la expresión de metaloproteinasas (MMP) que contribuyen a la inflamación y destrucción articular. Si bien se sabe que productos de degradación de Yersinia pueden detectarse en el LS, no se conoce aún como estos influenciarían la actividad de los fibroblastos, favoreciendo su rol patogénico. La IL-17 es una citoquina proinflamatoria secretada principalmente por células T activadas. Se ha reportado que los niveles de IL-17 son elevados en pacientes con AR, y que además estimularía la diferenciación a osteoclastos induciendo la expresión de RANKL y la producción de MMPs, favoreciendo la destrucción articular y la inflamación autoinmune. Sin embargo, actualmente, los datos disponibles sobre niveles de esta citoquina en LS son escasos. No se conoce cómo antígenos de Yersinia influenciarían la producción de IL-17 por células mononucleares ni si podrían inducir la expresión de IL-17R en fibroblastos. La caracterización de antígenos bacterianos asociados a artritis contribuirá al conocimiento de los mecanismos patogénicos de artropatías regionales aportando nuevos blancos para posibles intervenciones terapéuticas. OBJETIVOS GENERALES: Realizar un estudio regional de la asociación entre infección bacteriana y artropatías en pacientes con AR o SpA de la ciudad de San Luis, investigando la respuesta o presencia de antígenos de Yersinia enterocolitica, o de otras bacterias (Salmonella enteritidis o Shigella flexneri), con fines comparativos. Estudiar la capacidad de diferentes antígenos de Yersinia de inducir en un cultivo in vitro de fibroblastos la expresión de factores involucrados en la inflamación y destrucción articular. Investigar la participación de IL-17 como mecanismo inmunopatogénico de la estimulación bacteriana en las artropatías estudiadas. RESULTADOS: Se obtuvieron los LS de 124 pacientes: 18 SpA, 66 AR y 40 osteoartritis (OA) (controles). Se estudió por ELISA, la respuesta de IgA frente a diferentes antígenos de Yersinia, Salmonella y Shigella [Lisado crudo (LC), proteínas de membrana externa (PME), de citoplasma (CIT), de sobrenadante (SN) y lipopolisacárido (LPS)]. IgA específica para las distintas preparaciones fue detectada en 47% de los LS con SpA y 72% de los LS con AR. En SpA, 20% presentaban IgA contra Yersinia, 40% contra Salmonella y 40% contra Shigella. De las AR, 46% presentaban IgA contra Yersinia, 51% contra Salmonella y 47% contra Shigella. El 17,5% de los pacientes con respuesta de anticuerpos positiva para Yersinia por ELISA presentó respuesta positiva frente a Yops por Western blot. En el caso de PME de Salmonella, se observó diferencia significativa en la frecuencia de LS positivos para IgA en AR y SpA (PME Salmonella vs PME Yersinia p<0,06 y p<0,0003, respectivamente). Cuando se comparó la frecuencia de detección entre las diferentes preparaciones antigénicas, se observaron diferencias significativas solo para Salmonella (LC vs PME p<0,07; PME vs SN p<0,00001, PME vs LPS p<0,02; CIT vs SN p<0,05; Fisher). Cuando se analizó la intensidad de la respuesta, se observó también una diferencia significativa con PME de Salmonella (PME Salmonella vs PME Yersinia p<0,05; vs SN Yersinia p<0,01; vs LPS Yersinia p<0,01; vs SN Salmonella p<0,01; vs CIT Shigella p<0,05; vs SN Shigella p<0,01 y vs LPS Shigella p<0,01; Kruskal-Wallis con Steel-Dwas). Se observó correlación significativa entre la respuesta a los antígenos bacterianos y la respuesta anti-colágeno tipo I (membrana sinovial) y tipo II (cartílago articular) (p<0,05, Spearman). Se estudiaron tres casos de ARe (P1, P2 y P3). En P1, IgA fue marcada contra Salmonella (PME, LPS, SN y LC), como así también el Western blot, observándose reacción contra siete PME (56-25 kDa). Se observó respuesta proliferativa en presencia de LC de Salmonella. No se detectó DNA bacteriano en LS. En P2 y P3 se destacó la respuesta contra antígenos de Shigella (P2: SN, y P3: PME, LC y SN) y Western blot de P2 y P3 fue positivo para PME y SN de esta bacteria, destacándose la reacción contra una banda de 94 kDa en SN. No se observó respuesta proliferativa, ni DNA bacteriano en LS. HLA-B27 fue positivo en P3. Se desarrolló un método de PCR que permita detectar Yersinia en LS de pacientes. Para ello se contaminaron dos LS (OA y SpA) con diferentes diluciones de Yersinia enterocolitica. Se extrajo el ADN con dos métodos: fenol-cloroformo y CTAB-fenol-cloroformo. Se empleó un primer específico (ail) para Yersinia y un control interno de inhibición (ß-globina humana). No hubo diferencias apreciables en las lecturas a 260 nm y en la relación 260/280 entre los métodos utilizados. Sin embargo, tanto el control interno (ß-globina) como el gen específico de Yersinia, logró amplificarse correctamente sólo cuando el método de extracción utilizaba CTAB. Se logró detectar hasta 1 ufc de la bacteria, demostrando la sensibilidad de la técnica desarrollada. Se seleccionaron 5 LS de SpA y 11 LS de AR con respuesta de IgA antibacteriana positiva y 4 LS de OA controles, se extrajo ADN con la metodología previamente optimizada (método fenol-CTAB) y se realizó PCR. El gen constitutivo (β-globina) fue amplificado positivamente en todas las muestras, sin embargo, no se observó presencia de ADN de Yersinia ni de Salmonella, en ninguna de las muestras ensayadas. Se obtuvieron cultivos de fibroblastos a partir de LS de pacientes con AR, SpA y OA. Pasajes del 2-6 fueron usados para los experimentos. Se realizaron observaciones en microscopio de contraste de fase, Giemsa e inmunoflorescencia específica (prolyl 4-hidroxilasa humana). Luego de 48 hs, se observaron células adheridas redondas, estrelladas y en forma de huso, con núcleos y nucleolos prominentes. Aproximadamente dos semanas después del inicio del cultivo, los fibroblastos empezaron a desprenderse de estos grupos y a expandirse. Cerca de los 20-30 días de cultivo, dependiendo de la muestra original, el cultivo tuvo suficientes fibroblastos en un 90% de confluencia, por lo cual se realizó la remoción de las células por tripsinización y el primer pasaje. A partir del primer pasaje, la mayoría de las células presentaron la morfología fibroblástica, y los cultivos empezaron a repicarse de manera constante cada 14-17 días hasta que el mismo llegó a la senescencia. Se detectó expresión basal de ARNm de MMP-1 y TLR-2 en un cultivo de fibroblastos no estimulados con antígenos de Yersinia, de una SpA y una AR, independientemente del tiempo de estímulo. A las 48 hs de estímulo con Yersinia muerta por calor (HKY), se observó un aumento, dosis dependiente, en la expresión de MMP-1 y TLR-2 en la SpA. En la AR, se observó un aumento de MMP-1 y TLR-2 luego de 12 hs de estímulo con LPS de Yersinia y zimosán. Con respecto a RANKL, se observó una expresión basal que no fue alterada con los estímulos. Por zimografía se evaluó la producción de MMP-1 en sobrenadante de cultivo de fibroblastos de SpA y AR estimulados. Se observaron dos bandas (50 y 58 kDa) con actividad proteolítica luego del estímulo con HKY o LPS de Yersinia a las 48 y 72 hs en sobrenadantes de fibroblastos de SpA. La inducción de MMP-1 fue confirmada por Western blot, donde una banda específica correspondiente a la pro-MMP-1 fue observada. No se observó actividad proteolítica en los sobrenadantes de cultivos de fibroblastos de AR. Se determinaron los niveles de IL-17, IFN-γ, IL-23(p40/19), IL-1β e IL-9 en LS de pacientes con SpA, AR y OA por ELISA. En SpA, los niveles de citoquinas proinflamatorias fueron: IL-17: 15,62 pg/ml (53% de los pacientes); IFN-γ: 13,3 pg/ml (58%), IL-23: 23,2 pg/ml (39%); IL-1β: 32,3 pg/ml (78%) e IL-9: 1,66 pg/ml (6%). En AR, detectamos niveles significativamente elevados de IFN-γ (31,3 pg/ml, 97%) comparado con otras citoquinas (p< 0,05) y con otras artropatías (p< 0,05). En OA, la citoquina inflamatoria principal fue la IL-1β (19,31 pg/ml, 58%) y el IFN-γ (12,1 pg/ml, 69%). Las concentraciones de IL-17 fueron significativamente mayores en AR y SpA comparadas con OA (SpA vs OA p< 0,001 y AR vs OA p< 0,0001) (Kruskal-Wallis con Steel Dwass). Además, se observó en AR correlación entre los niveles de IL-17 y la actividad de la enfermedad (DAS-28) (Spearman). Con respecto a la expresión del IL-17R en cultivos de fibroblastos estimulados con antígenos de Yersinia, se detectó expresión basal del ARNm en cultivos no estimulados de una SpA y una AR. En el cultivo de SpA no se observó aumento de la expresión del ARNm del receptor frente a los estímulos y en la AR, se observó un aumento en la expresión luego de 12 hs de estímulo con LPS de Yersinia y zimosán. Finalmente, se investigaron los niveles de IL-17 en sobrenadantes de cultivo de células mononucleares de LS estimuladas con antígenos de Yersinia, y se observó secreción de esta citoquina frente al estímulo con LC (3-6 pg/ml) y HKY (10 y 21 pg/ml con estímulos de 107 y 108 bacterias/ml, respectivamente), tanto en cultivos de SpA como AR CONCLUSIONES: Respuesta de IgA específica contra bacterias artritogénicas fue detectada en LS de pacientes con AR y SpA de la ciudad de San Luis, indicando infección persistente y estimulación crónica de las mucosas. Se destacó la respuesta frente a PME y LPS, los que podrían ser considerados antígenos blancos en la respuesta inmune. Se observó respuesta de anticuerpos frente a más de una bacteria, lo que sugiere posible reacción cruzada y/o infección mixta por los microorganismos ensayados. Se destacó la correlación entre la respuesta antibacteriana de anticuerpos y la respuesta a colágenos tipo I y tipo II, apoyando de esta manera la asociación entre una infección bacteriana y la enfermedad articular. A pesar de utilizar un método optimizado de extracción de ADN y PCR, no se logró detectar ADN bacteriano en los LS. Resultados preliminares indican que antígenos de Yersinia aumentarían la expresión de TLR-2 y MMP-1 (colagenasa) en SpA y AR, y la producción de pro-MMP-1 en SpA. Demostramos que pacientes con AR y SpA, de la ciudad de San Luis, presentan niveles aumentados de IL-17 en LS comparados con pacientes con OA. Además, los perfiles de citoquinas son claramente diferentes entre las artropatías, indicando mecanismos patofisiológicos específicos en cada una de ellas. Resultados preliminares indican que el IL-17R se expresa basalmente en fibroblastos y su expresión no sería afectada por el estímulo microbiano. Finalmente, antígenos de Yersinia son capaces de inducir la producción de IL-17 en células mononucleares de pacientes con AR y SpA, sugiriendo que antígenos bacterianos estimulan la secreción de esta citoquina, y a través de ella, pueden inducir inflamación y destrucción articular. De este modo, la aparición de la artritis podría ser una consecuencia del encuentro entre una bacteria artritogénica y un huésped predispuesto, en el cual debido a razones genéticas o cambios a nivel intestinal se vería favorecido el pasaje de productos microbianos a la articulación, los cuales podrían causar respuesta inflamatoria, activación inapropiada de células, como linfocitos Th17 y fibroblastos, exposición de antígenos articulares (colágenos) y autoinmunidad. Información suministrada por el agente en SIGEVA