Validación de una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga en alimentos cárnicos.

Tesis

Resumen *

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un importante patógeno emergente transmitido por alimentos, asociado al síndrome urémico hemolítico (SUH). En Argentina el SUH es endémico, y el principal reservorio de STEC son los rumiantes. E. coli O157:H7 es el prototipo de más de 150 serotipos de STEC que comparten el mismo potencial patogénico. En la industria de alimentos cárnicos se realiza la detección de STEC O157:H7/NM de acuerdo al Código Alimentario Argentino (Artículos 156tris, 255, y 302). En Argentina, la frecuencia de detección de STEC no-O157 en casos de SUH es del 30%; sin embargo, la detección de STEC no-O157 no se realiza rutinariamente. Karch y Meyer desarrollaron la técnica de PCR-MK para la detección de los genes stx1 y stx2, los que codifican para las toxinas Shiga 1 y Shiga 2, respectivamente. El objetivo del trabajo fue validar la técnica de PCR-MK en presencia de un control interno de amplificación (IAC), para utilizarla como tamizaje en la detección de STEC a partir de alimentos cárnicos. Se construyó un IAC competitivo, y se estandarizó la técnica de PCR-MK usando el IAC. Se compararon las secuencias de 29 variantes stx con la secuencia de los cebadores MK1 y MK2 por bioinformática, comprobándose que la técnica de PCR-MK podría amplificar 23 variantes stx. Se validó la técnica de PCR-MK + IAC en una etapa intralaboratorio. Se utilizaron 50 cepas productoras de toxina Shiga y 30 cepas no toxigénicas. Se determinaron los siguientes parámetros: a) rango de trabajo (límite de detección y límite de corte), b) selectividad (inclusividad y exclusividad), y c) robustez. El límite de corte fue de 105 UFC/50 l de mezcla de reacción de PCR. La técnica presentó 100% de inclusividad, exclusividad, y precisión analítica. No se observaron diferencias en el desempeño de la técnica de PCR-MK + IAC al introducir 3 variables en forma deliberada, por lo tanto se consideró que la técnica fue robusta. Se evaluó la capacidad de la técnica para detectar STEC en muestras de carne picada contaminadas experimentalmente, luego de un paso de enriquecimiento. Todas las muestras de carne picada inoculadas con 10-20 y 100-200 UFC de STEC/25 g fueron positivas. La técnica de PCR-MK + IAC es válida para la detección de STEC O157 y no-O157 en alimentos cárnicos luego de un paso de enriquecimiento, y se propone como técnica de tamizaje en el marco de una metodología de detección. La técnica de PCR-MK + IAC es válida para la detección de STEC O157 y no-O157 en alimentos cárnicos luego de un paso de enriquecimiento, y se propone como una técnica de tamizaje en el marco de una metodología de detección. La utilización de técnicas de diagnóstico, sensibles y específicas, contribuye al fortalecimiento de la vigilancia epidemiológica permitiendo establecer las estrategias de control y prevención de las enfermedades transmitidas por alimentos asociadas con STEC. Información suministrada por el agente en SIGEVA