Modificaciones inducidas por lipopolisacárido bacteriano sobre parámetros funcionales en células tiroideas

Tesis

Resumen *

Numerosos estudios han demostrado que la endotoxina lipopolisacárido (LPS) es un potente activador de numerosas respuestas fisiológicas y capaz de activar a múltiples genes en diversos tipos celulares. Si bien LPS principalmente estimula la actividad de células del sistema inmune, ha sido recientemente demostrado que la endotoxina afecta la actividad de diversas células endocrinas. Sin embargo, se desconoce el efecto de la endotoxina sobre la célula tiroidea. Escasos estudios previos han informado resultados contradictorios sobre el efecto de LPS sobre el efecto de LPS en la función tiroidea. Ha sido propuesto además que LPS juega un rol como factor ambiental en el inicio y desarrollo de patologías autoinmunes. Los modelos experimentales de tiroiditis consisten en la inducción de la patología mediante la utilización de péptidos de TG y adyuvantes inmunoestimulatorios. Sin embargo, cuando el adyuvante utilizado es el LPS además de incrementar la inmunogenicidad de los autoantígenos como la hacen otros adyuvantes, LPS interacciona con las células tiroideas induciendo en la misma la expresión y la liberación de quimiocinas, moléculas que atraen linfocitos T, con lo que facilitarían la infiltración de la glándula. Por otra parte, ha sido recientemente documentado que una incrementada expresión de proteínas que se comportan como autoantígenos capaces de desarrollar autoinmunidad está asociada con la etiología y la patología de varios procesos autoinmunes. Sin embargo, no se ha evaluado hasta el momento la posibilidad que LPS ejerza un efecto directo sobre la expresión de proteínas que se comportan como autoantígenos en las enfermedades autoinmunes tiroideas. Tampoco ha sido estudiado el impacto de LPS sobre la función, diferenciación y crecimiento tiroideo. La biosíntesis de hormonas tiroideas comprende la captación de ioduro por el transportador sodio-ioduro (NIS) y la iodación de tiroglobulina (TG) catalizada por la peroxidasa tiroidea (TPO) en presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2), con posterior acoplamiento de los residuos iodotirosina de la TG. La expresión de los genes de diferenciación tiroidea NIS, TG y TPO está regulada por la tirotrofina (TSH). En los mecanismos de regulación participan principalmente tres factores de transcripción, el factor de transcripción tiroideo-1 (TTF-1), el factor de transcripción tiroideo-2 (TTF-2) y el factor de transcripción con dominios apareados 8 (Pax8). En el presente trabajo se ha estudiado la acción de LPS sobre parámetros de función, diferenciación y proliferación de células tiroideas en una línea celular de tiroides de rata no tumoral y altamente funcional, las células FRTL-5. Estas células mantienen las características de una célula tiroidea diferenciada normal, tales como la respuesta a la tirotrofina (TSH) y la expresión de genes específicos tiroideos. Por otra parte, presentan la ventaja de no estar contaminadas con otros tipos celulares, permitiendo de este modo evaluar la acción directa de la endotoxina sobre la célula tiroidea. En este trabajo se analizó el efecto de LPS sobre la captación de ioduro, un parámetro funcional tiroideo y la expresión de los genes que son marcadores de la diferenciación tiroidea (TG, NIS y TPO); así como sobre la proliferación de las células tiroideas. Se observó que la endotoxina (0.01-10 µg/ml) indujo una estimulación de la captación de ioduro inducida por TSH, con un máximo efecto a una concentración de 0.1 µg/ml. El efecto estimulante varió con el tiempo de incubación con LPS, siendo máximo luego de 48 h de incubación. A fin de investigar la posibilidad de que LPS modificara la expresión de TG, se analizó el nivel de TG por inmunocitoquímica, microscopía confocal y Western blot. En todos los casos se demostró que LPS incrementó el nivel de TG con un máximo de incremento luego de 48 h de tratamiento con LPS 0.1 µg/ml. Tanto por inmunocitoquímica como por microscopía confocal se pudo evidenciar que LPS no modificó la morfología celular. Se comprobó que el incremento en la expresión de TG inducido por LPS se acompañó de un incremento en el nivel de mRNA de TG. A fin de profundizar en el mecanismo por el cual LPS estimuló la expresión de TG, se analizó la actividad del promotor mínimo de TG y se evidenció que LPS estimuló la actividad del promotor mínimo de TG. El elemento C es crucial para la máxima expresión del promotor de TG y contiene un sitio de unión a Pax8 que empalma con un sitio de unión a TTF-1. Se observó que el tratamiento con LPS indujo un incremento de la actividad de un constructo conteniendo cinco sitios C en tándem, indicando que este sitio estaría involucrado en la estimulación del promotor inducida por LPS. Cuando las células fueron transfectadas con un vector conteniendo el promotor mínimo de TG mutado en el sito de unión a Pax8 se evidenció que el mismo perdía su respuesta a LPS, lo cual sugirió que Pax8 participaría en el mecanismo estimulatorio de LPS sobre la actividad del promotor de TG. Por ensayos de retraso en gel y de supershift realizados con oligonucleótidos marcados correspondientes al sitio C del promotor mínimo de TG (oligo C), se comprobó que sólo TTF-1 y Pax8 se unieron al sitio C en respuesta al tratamiento con LPS y que la endotoxina incrementó la actividad de unión al ADN de ambos factores. Esto se confirmó mediante la utilización de mutantes del sitio C que sólo unen TTF-1 (oligo Ct) y Pax8 (oligo Cp), o ensayos realizados con el oligo C radiomarcado en presencia de los oligos Ct y Cp fríos. Se analizó también la expresión de TTF-1 y Pax8 en respuesta a LPS observándose un incremento del nivel de mRNA y de proteína de ambos factores de transcripción. De este modo, la acción de LPS sobre la expresión del gen de TG sería ejercida a nivel transcripcional, y en el mecanismo participaría una mayor transactivación del elemento C mediada por los factores TTF-1 y Pax8. Tanto un aumento de la unión de estos factores al sitio C, como del nivel de los mismos podría estar involucrado. Con el fin de evaluar la posibilidad que una modificación en la expresión del transportador NIS estuviera involucrada en los cambios sobre la captación de ioduro observados por efecto de LPS, se analizó el nivel de NIS en células FRTL-5 tratadas con la endotoxina. Se demostró que LPS incrementó el nivel de NIS en la célula tiroidea (inmunofluorescencia y microscopía confocal). De este modo, el incremento de NIS inducido por la endotoxina podría explicar la estimulación observada sobre la captación de ioduro. Se comprobó también que LPS ejerce su efecto a nivel transcripcional incrementando la actividad del promotor de NIS. Dado que la expresión de los genes de TG, NIS y TPO es regulada por un mecanismo similar y en base a los presentes resultados que indican un efecto estimulante de LPS sobre la expresión de TG y NIS, se estudió el efecto de la endotoxina sobre la expresión de TPO. Se observó que LPS incrementó la actividad del promotor mínimo de TPO. En la expresión del gen de TPO, el sitio de unión a TTF-2 (sitio Z) juega un papel clave y por ello se analizó el rol funcional de este sitio en el efecto de LPS. En células transfectadas con un vector conteniendo doce sitios Z en tándem se comprobó que la endotoxina incrementó la actividad del constructo, evidenciando que TTF-2 estaría involucrado en la estimulación del promotor de TPO inducida por LPS. De este modo, es posible que LPS estimule la expresión de los genes de TG, NIS y TPO mediante la participación de los factores de transcripción tiroideos. La generación de peróxido de hidrógeno es un paso limitante de la biosíntesis de hormonas tiroideas en presencia de concentraciones fisiológicas de ioduro. Dado que LPS incrementó la captación de ioduro y la expresión de genes involucrados en la biosíntesis de hormonas tiroideas, se evaluó la producción de peróxido de hidrógeno en células tratadas con LPS. Se observó que LPS indujo un incremento de la producción de peróxido de hidrógeno en el medio de cultivo de las células tiroideas. Por otra parte, se evaluó la posible participación de LPS en el proceso de proliferación de las células FRTL-5. Se observó que LPS incrementó la incorporación de timidina inducida por TSH. La estimulación ejercida por LPS fue dependiente del tiempo de incubación y varió con la concentración de la endotoxina, observándose en todos los tiempos el efecto máximo a una concentración de 0.1 µg/ml. Los resultados del presente trabajo permitieron concluir que LPS es capaz de ejercer una acción estimulante sobre parámetros de función tiroidea, como la captación de ioduro y de inducir la activación de genes de expresión específica en la célula tiroidea, como así también de incrementar la producción de peróxido de hidrógeno y la proliferación celular. Entre los elementos modificados por LPS se encuentran dos de los principales autoantígenos tiroideos. TG y TPO. Estos hallazgos podrían ser de potencial importancia clínica por su posible implicancia en la fisiopatología tiroidea. Información suministrada por el agente en SIGEVA