Funcionalidad de la región carboxilo terminal de NADH deshidrogenasa-2: una Cu(II)-reductasa de la cadena respiratoria de Escherichia coli

Tesis

Resumen *

NADH deshidrogenasa de tipo II (NDH-2) de la cadena respiratoria de Escherichia coli consiste en una única cadena polipeptídica de 433 aminoácidos, codificada por el gen ndh. Es una flavoproteína de membrana que contiene al cofactor FAD unido en forma no covalente. Existe poca información sobre la estructura de las NDH-2s. Los modelos estructurales se limitan a estudios teóricos basados en la similitud de secuencia con otras flavoenzimas con estructuras resueltas. Durante esta Tesis se demostró la liberación de NDH-2 de E. coli de la membrana plasmática, luego de ser sometida a condiciones de alta fuerza iónica o elevado pH, revelando la disposición periférica de la enzima y la naturaleza anfipática de su unión. Mediante la construcción de mutantes truncas (Trun-1 a Trun-4) se determinó que la porción Arg390- Ala405 de la región C-terminal de NDH-2 es suficiente para mantener la proteína unida a la membrana. Trun-3 fue elegida para su caracterización, ya que comprende los aminoácidos del modelo teórico de NDH-2. Por su naturaleza citosólica, dicha proteína fue purificada en ausencia de detergente, permitiendo una manipulación más sencilla y un mayor rendimiento. Mediante fluorescencia, se demostró la ausencia del cofactor FAD en Trun-3. Luego de la adición de FAD, la enzima trunca recuperó actividad, con valores de Vmax menores que la enzima nativa pero manteniendo valores de Km similares. Esto sugiere que la región Cterminal participaría en la organización de la enzima, permitiendo la unión y el mantenimiento del cofactor unido y conservando la correcta orientación del sitio de unión a quinonas. Se caracterizó estructuralmente Trun-3, comparando con NDH-2. Se demostró que la eliminación de la región C-terminal no afecta la globularidad de NDH-2. Por otro lado, se observó que la adición del cofactor no fue necesaria para inducir el estado plegado de Trun-3, ya que la apoproteína presentó una conformación α/β definida. La unión del FAD afectó levemente la estructura de la variante trunca. Mediante la obtención de una mutante puntual en la histidina 408 de NDH-2, que resultó ser activa solo en presencia del cofactor, se sugirió que este residuo participaría directamente en la unión al FAD o, que la mutación alteraría dicha unión por cambios conformacionales. Trun-3 y NDH-2 sufrieron diversos cambios funcionales/conformacionales en función del aumento de temperatura. Las temperaturas de transición media (Tm) fueron aproximadamente 5-10°C superiores en la versión trunca que en NDH-2, indicando que la ausencia de la región C-terminal aumentaría la estabilidad estructural de Trun-3. Sin embargo,Trun-3 perdió actividad a temperaturas inferiores respecto a NDH-2, probablemente debido a una pérdida paulatina del cofactor. La variante Trun-3 serviría como modelo para llevar a cabo estudios estructurales de alta resolución de NDH-2, debido a su naturaleza citosólica y a su sencilla manipulación. Información suministrada por el agente en SIGEVA