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Tesis
Autoría
Fecha
01/01/2005
Resumen
Información suministrada por el agente en
SIGEVA
El parto está dividido en dos etapas o fases: una primera relativamente larga, fase preparatoria o condicionante, y una segunda corta y rápida, la fase activa. Para el momento en que comienza la fase activa, los órganos del canal de parto deben estar preparados: es necesario que el útero sea capaz de producir contracciones intensas y coordinadas y que el cérvix se dilate fácilmente ante la presión del feto. También es necesaria una extensa...
El parto está dividido en dos etapas o fases: una primera relativamente larga, fase preparatoria o condicionante, y una segunda corta y rápida, la fase activa. Para el momento en que comienza la fase activa, los órganos del canal de parto deben estar preparados: es necesario que el útero sea capaz de producir contracciones intensas y coordinadas y que el cérvix se dilate fácilmente ante la presión del feto. También es necesaria una extensa separación de los huesos pélvicos para permitir el pasaje de los fetos durante el parto. Por lo tanto, un parto exitoso requiere que la fase activa del mismo se inicie recién cuando los tejidos del útero, el cérvix y la sínfisis púbica ya estén preparados. Esta preparación tendría lugar durante la última etapa de la gestación. Todas las hipótesis propuestas para explicar el inicio del parto se basan en el cambio de un medio ambiente endocrino dominado por la Pg a otro dominado por los Eg. En la mayoría de los mamíferos este cambio se realiza a través de modificaciones en los niveles circulantes de Pg y Eg maternos (disminución de Pg e incremento de Eg), causados por un cambio en la actividad metabólica placentaria (ovejas) o por la regresión del cuerpo lúteo (ratas, ratones, conejos, cabras y cerdos). Por el contrario, en cobayos, primates no humanos y mujeres, el cambio de medio ambiente hormonal del parto no está asociado con cambios significativos en los niveles séricos hormonales. Sin embargo, los niveles séricos no reflejan necesariamente la actividad local de las hormonas en los tejidos: la acción ejercida por las mismas a nivel tisular depende de varios factores (concentración de hormona libre, metabolismo local, etc). Actualmente, se considera que la acción de una hormona depende en gran parte de la existencia de receptores celulares y la maquinaria post-receptor a la cual el receptor está acoplado. Teniendo en cuenta estos aspectos del mecanismo de acción hormonal, para las especies que cursan el parto sin variaciones significativas en los niveles circulantes de Eg y Pg, se ha propuesto que la acción biológica que estas hormonas ejercen sobre el útero no estaría determinada por variaciones en sus niveles circulantes sino por cambios en la susceptibilidad del tejido. Los mecanismos que modifican la susceptibilidad de los tejidos a las hormonas circulantes provocando una variación en la acción biológica de la hormona por una vía diferente a los cambios en la concentración sérica hormonal, se han denominado mecanismos funcionales. Uno de los principales mecanismos funcionales propuestos para explicar el inicio del trabajo de parto, sin que existan variaciones en la concentración sérica de Pg y Eg, es la modificación en la expresión tisular de sus receptores Además, algunos autores postulan que la Pg promovería una regionalización funcional en el útero. En la zona alta del útero habría una caída en la acción biológica de la Pg (functional progesterone withdrawal) mientras que en la zona baja ocurriría un aumento de la misma o se mantendría sin variaciones. La caída funcional de Pg en el segmento uterino alto (SUA) permitiría el estímulo de los Eg sobre la expresión de los genes de proteínas asociadas a la contracción (functional estrogen activation), aumentando la actividad contráctil en esta zona, mientras que el segmento bajo seguiría bajo el bloqueo de la Pg manteniéndose en estado de relajación. La hipótesis que orientó el presente trabajo supone que los órganos de todo el canal de parto se preparan sincronizadamente durante la última parte de la gestación a través de mecanismos funcionales que modifican la susceptibilidad de sus tejidos a los niveles circulantes de Pg y Eg. El uso del cobayo, que es un modelo animal con una endocrinología de la preñez y del parto similares a la de la mujer, nos permitió investigar si en los tejidos de los órganos del parto se producen modificaciones en la expresión tisular de los receptores durante la última etapa de la gestación presentando un patrón de regionalización determinado. Además, investigamos una posible asociación entre la remodelación del colágeno, como principal proceso fisiológico de adaptación del cuello uterino durante la etapa preparatoria del parto, y la expresión de RE y RP, como mecanismo funcional responsable de modificar la susceptibilidad del tejido a los niveles circulantes de Pg y Eg. Para este trabajo se sacrificaron cobayos machos y hembras no preñadas y cobayos hembras en distintos estadios de la gestación y posparto. Las hembras no preñadas fueron sacrificadas en el estro. De cada animal se obtuvo suero y se disecó el cérvix, los cuernos uterinos, y el ligamento interpúbico. Las muestras, destinadas para histología, fueron procesadas hasta su inclusión en tacos de parafina siguiendo técnicas histológicas de rutina (Junqueira y col., 1979). Una porción del cérvix, de los cuernos uterinos y del ligamento interpúbico fue obtenida en condiciones de esterilidad, pesada, congelada inmediatamente en nitrógeno líquido y conservada a -80°C para su posterior procesamiento para extracción de ARN o de proteínas. Las determinaciones de E2 y Pg se realizaron en sueros de hembras en estro (Es), preñadas (D42, D56 y D63 de gestación), posparto inmediato (PPi) y posparto temprano (1DPP). Las determinaciones se realizaron mediante un análisis enzimoinmunométrico quimioluminiscente secuencial en fase sólida, utilizando un analizador IMMULITE 2000. Como esta es la primera vez que este sistema diagnóstico es usado en muestras de cobayos, previamente se realizó la validación del método. Los perfiles séricos obtenidos nos permitieron confirmar que, en el cobayo, el parto se lleva a cabo sin cambios significativos en la circulación periférica de los niveles de E2 y Pg. Los niveles de colágeno organizado fueron evaluados cuantitativamente mediante la medición de la intensidad de birrefringencia, por el método de Picrosirius-polarización. Para ello, los cortes histológicos fueron teñidos con Picrosirius (solución saturada de Sirius rojo al 0,1% en ácido pícrico). También se caracterizó la infiltración de polimorfonucleares neutrófilos mediante la tinción de Giemsa prolongado, adaptada para cortes en parafina. Analizando los resultados de la cinética de la infiltración de neutrófilos en asociación con la remodelación del colágeno, observamos que ambos procesos biológicos están relacionados temporalmente en el cérvix pero no en el útero. Los resultados de esta tesis demuestran que los momentos de máxima remodelación del colágeno en el cuello uterino coinciden con la mayor infiltración de polimorfonucleares neutrófilos al tejido, mientras que en el útero ambos procesos están temporalmente disociados: en el momento en que los neutrófilos invaden el útero las fibras de colágeno ya han completado los mayores cambios en sus niveles de organización. La infiltración de neutrófilos y la remodelación del colágeno en el útero del cobayo en el momento del parto serían fenómenos independientes. La expresión de receptores para hormonas esteroides fue evaluada por inmunohistoquímica (REα y RP) y por RT-PCR competitiva (REα y REβ), en el segmento uterino bajo (SUB), el cérvix y la sínfisis púbica. En el útero y el cérvix, el estudio de la expresión de RP y REα por inmunohistoquímica se realizó en las células del epitelio luminal, el subepitelio y la región muscular, desde el D42 de la gestación hasta 1 día posparto (D42, D56, D63, PPi y 1DPP). En el útero también fue evaluada la expresión de REα y RP en las células del epitelio glandular. La expresión de REα y RP se hizo por inmunohistoquímica, usando anticuerpos primarios generados para su uso en biopsias de otras especies. Previamente, se confirmó su especificidad contra RP y REα de cobayos por medio de la técnica de Western-blot. Luego, se realizaron las inmunomarcaciones en cortes de 5 m de espesor con el método avidina-biotina peroxidasa, siguiendo protocolos previamente descriptos por nuestro grupo. La expresión del ARNm de REα y REβ fue evaluada por transcripción reversa (RT) seguida de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva (RT-PCR competitiva). En este trabajo de tesis se usaron competidores del tipo heterólogo, para lo que se utilizó una técnica desarrollada en nuestro laboratorio (Ramos y col., manuscrito en preparación). Para ello, se realiza una PCR con oligonucleótidos específicos para REα o REβ del cobayo, utilizando como molde el ADN genómico del fago lambda () que no posee la secuencia de genes que queremos estudiar. Para lograr productos de amplificación usamos un protocolo de ciclado con muy baja temperatura de annealing en los ciclos iniciales, forzando de esta manera la obtención de fragmentos de ADN cuyos extremos 5’ y 3’ poseen las secuencias de los oligonucleótidos utilizados como cebadores (primers). Posteriormente, se procedió a la inserción del fragmento de ADN seleccionado como competidor en un plásmido pBluescript (pSK-) (Stratagene, USA). La cepa bacteriana utilizada fue E.coli DH5 (Invitrogen™) y como vector de transformación se usó el plásmido pBluescript SK- (Stratagene®). Se estableció el rango de diluciones del fragmento de ADN competidor para cada RE. Para ajustar y corregir la variabilidad en la carga inicial de ADN entre muestras, se hicieron reacciones en cadena de la polimerasa para la ARN ribosomal de la subunidad 18S (r18S) como normalizador interno. La expresión de ARNm de REα y REβ fue cuantificada en muestras de segmento uterino bajo, cérvix y ligamento interpúbico de cobayos hembras de D42 y D60 de la gestación y PPi. Los resultados de la inmunohistoquímica demuestran que el parto transcurre con altos niveles de expresión de RP en la región muscular de la zona baja del útero. Este resultado sugiere que no habría una caída en la acción biológica de la Pg en el SUB mediada por un menor número de RP. Esto apoyaría el concepto de regionalización propuesto para el útero, según el cual el SUB se mantendría en estado de relajación por una persistente acción de la Pg que inhibiría el estímulo de los Eg sobre la expresión de los genes de las proteínas activadoras de la contracción en esta zona del útero. Otra posible explicación para la alta expresión de RP en el SUB durante el parto es que ocurra una caída en la acción biológica de la Pg sobre el miometrio uterino de esta zona por un mecanismo diferente. Los resultados obtenidos en esta tesis en los Western blot del RP de úteros de cobayo, demuestran que hay cuatro isoformas de RP, similares a las descriptas en mujeres. Este hallazgo nos permite sugerir que en el cobayo, al igual que en la mujer, el mecanismo funcional que provocaría una disminución en la acción de la Pg sobre las células musculares uterinas podría consistir en un cambio en la relación RP-A/RP-B. Teniendo en cuenta esta última posibilidad, y con los resultados obtenidos en la expresión de RP en la zona baja del útero (SUB), no podemos concluir si existe o no una disminución funcional de la acción de la Pg en esta región del útero. Por otro lado, ha sido descripto que el RE presenta una potente acción inhibidora sobre el estímulo de la actividad transcripcional promovida a través del REα en células que coexpresan ambos receptores. Esta propiedad fundamenta el hecho de que los cambios en la expresión de REα y de REβ puedan ser tomados como un mecanismo funcional que modifique la acción biológica de los Eg circulantes sobre las células del SUB (activación funcional a Eg). El uso de la metodología de RT-PCR competitiva nos permitió cuantificar con precisión la expresión de los ARNm del REα y REβ. Observamos que, a medida que progresa la gestación y se acerca el parto, los ARNm de REα y REβ aumentan de forma paralela en el SUB. Este incremento simultáneo y paralelo estaría indicando que el estímulo promovido por los Eg a través de REα podría estar bloqueado por la alta expresión de REβ en esta zona baja del útero (SUB). La confirmación de esta hipótesis requiere, entre otros, estudios que evalúen la co-localización celular de ambos RE. La alta expresión de RP y del ARNm de REβ en la porción baja del útero durante el parto sugeriría que esta región no se transformaría en un tejido con capacidad para generar contracciones intensas y coordinadas ante los altos niveles circulantes de agentes estimulantes como la OT y las PGs. En cuanto al cérvix observamos que, a medida que nos acercamos al parto, las células del estroma subepitelial disminuyen su expresión de RP mientras que mantienen una alta expresión de REα. A los resultados obtenidos por inmunohistoquímica, se suman los de la expresión del ARNm de REα y REβ cuantificado por RT-PCR competitiva. En el período evaluado, el ARNm del REβ no se expresó en el tejido cervical mientras que sí lo hizo el ARNm de REα. Estos resultados en su conjunto, significan que, durante la etapa preparatoria del parto, y de manera localizada en el estroma subepitelial del cuello uterino, se produce un cambio del estímulo endocrino con predominio de acción de la Pg a otro donde prevalecen las distintas acciones biológicas promovidas por los Eg. También analizamos si la remodelación del colágeno descripta tenía una asociación temporal con las variaciones halladas para la expresión de RE y RP en esta región tisular. El resultado de los análisis de correlación demostró que la remodelación del colágeno del cérvix durante la última etapa de la gestación está asociada temporalmente tanto con la caída en la expresión de RP como con la alta expresión del REα. En conjunto, los resultados descriptos para el cérvix sugieren que el proceso de ablandamiento que este órgano realiza como preparación para el momento del trabajo de parto, es desencadenado por cambios regionales en la expresión de RE y RP que sensibilizan al estroma cervical para responder a los altos niveles de Eg en circulación. Trabajos en realización en nuestro laboratorio aportarán más evidencias para confirmar esta hipótesis. Por último, pudimos observar que la progresiva relajación de la sínfisis púbica está relacionada con una disminución en la expresión de RP en el estroma del ligamento interpúbico. Junto con esta caída de RP en el estroma del ligamento, hay un aumento del ARNm de REα y una disminución en el de REβ. De manera similar a lo demostrado en el cérvix, la relajación del ligamento interpúbico durante la etapa preparatoria del parto también estaría asociada a un cambio funcional del microambiente endocrino que inhibiría el efecto biológico de la Pg mientras que se favorecería una mayor acción biológica de los Eg. A modo de resumen, los resultados presentados en esta tesis aportan evidencias originales que apoyan aspectos importantes del modelo de parto propuesto para mujeres y cobayos. Fundamentalmente, nuestros resultados demuestran que la acción biológica ejercida por la Pg y los Eg varía entre los tejidos de los distintos órganos involucrados en el parto (útero, cérvix y sínfisis), mediante una expresión diferencial de sus receptores. Esta expresión diferencial de RE y RP ocurre en la última etapa de la gestación, en función de las adaptaciones que cada órgano del canal de parto realiza durante la etapa preparatoria del mismo. Por último, pensamos que los resultados aportados en el desarrollo de esta tesis realzan la validez del cobayo como modelo animal para el desarrollo de estudios de endocrinología de la gestación y regulación del inicio del parto, y como modelo para la experimentación de drogas diseñadas para evitar un parto prematuro.
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