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Autoría
Fecha
01/01/2010
Resumen
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SIGEVA
En las células eucariotas, las proteínas que pasan a través del aparato secretor pueden glicosilarse ya sea por O-glicosilación y/o N-glicosilación. La aparición concertada de ciertas glicoformas ha mostrado ser relevante para la función de algunas proteínas y el establecimiento de muchos procesos fisiológicos y patológicos. Por ejemplo, variaciones en la glicosilación de las IgG pueden alterar su estabilidad, inmunoge...
En las células eucariotas, las proteínas que pasan a través del aparato secretor pueden glicosilarse ya sea por O-glicosilación y/o N-glicosilación. La aparición concertada de ciertas glicoformas ha mostrado ser relevante para la función de algunas proteínas y el establecimiento de muchos procesos fisiológicos y patológicos. Por ejemplo, variaciones en la glicosilación de las IgG pueden alterar su estabilidad, inmunogenicidad o afinidad. La glicosilación de las moléculas de adhesión que participan en el tráfico leucocitario, como el sistema de L-selectina, es también fundamental para la interacción con sus ligandos. El complejo enzimático oligosacariltransferasa (OST) es responsable de la N-glicosilación de las proteínas que translocan al retículo endoplásmico (RE). Se han descrito, en organismos superiores, dos genes de isoformas de la subunidad catalítica de OST, denominadas STT3-A y STT3-B. Estas isoformas difieren en especificidad de sustrato y tasa de actividad. Por otro lado, UDP-glucosa-glucosiltransferasa (UGGT) es una enzima del RE involucrada en el mecanismo de control de calidad de las glicoproteínas. Se han descubierto dos isoformas de UGGT en humanos denominadas HUGT1 y HUGT2, sin embargo HUGT2 no fue funcional ante las condiciones optimizadas para HUGT1. A pesar que el proceso de síntesis de las glicoproteínas ha sido muy estudiado, aún se desconocen el o los mecanismos responsables de la aparición de ciertas glicoformas de un modo concertado. En este trabajo analizamos, in vitro e in vivo, los roles de las enzimas OST y UGGT en este proceso. El modelo in vitro empleado fue un cultivo de células de hibridoma secretoras de IgG1 anti-DNP. Aquí evaluamos si la expresión de las isoformas de STT3 y UGGT podía ser regulada por progesterona (P4) afectando la glicosilación del anticuerpo; e investigamos el rol de las citoquinas IL-6 y PIBF. En este modelo, demostramos que P4 regula la incorporación de N-glicanos a la IgG1 de una forma dosis dependiente. A bajas dosis de P4 (10-10 M), se estimula la incorporación de N-glicanos mediante la inducción de una relación STT3-A/STT3-B específica, conseguida a través de la regulación de la concentración de PIBF. En cambio, con P4 10-6 M se inhibe la incorporación de N-glicanos por un mecanismo dependiente de IL-6. Además, detectamos la presencia de receptores de membrana de P4, de menor afinidad que los intracelulares, en el hibridoma. Estos receptores de membrana regularían junto con los intracelulares el patrón de glicosilación de la IgG1 a altas dosis de P4 (10-5 M). Por otro lado, demostramos que el hibridoma 112D5 expresa dos isoformas de UGGT, denominadas UGGT1 y UGGT2, regulables por P4. A diferencia de su homóloga de humano, UGGT2 presenta actividad glucosiltransferasa. Ninguna de las dos isoformas resultó ser indispensable para la viabilidad celular ni la maduración y glicosilación de la IgG1 secretada por el hibridoma. Posteriormente, evaluamos si la expresión de las isoformas de OST y UGGT podía ser regulada in vivo. Dado que P4 constituye un regulador esencial de la gestación, empleamos para este estudio un modelo murino de abortos (CBA/J x DBA/2J; alta tasa de resorción fetal) y comparamos los resultados con un modelo de gestaciones normales (CBA/J x BALB/c; baja tasa de resorción fetal). Además, considerando que la inducción de estrés por exposición a ultrasonido al día 5,5 de gestación incrementa la tasa de resorción fetal en la cruza CBA/J x DBA/2J y a su vez disminuye la concentración de P4, analizamos también la expresión de las proteínas mencionadas en hembras estresadas. La expresión de las proteínas fue analizada por inmunohistoquímica en sitios de implantación del día 6,5 de gestación. Los resultados mostraron un patrón de expresión de UGGT1 similar en ambas cruzas de ratones, expresándose principalmente en glándulas y epitelio del útero. En cambio, si bien detectamos expresión de UGGT2 por western blot de sitios de implantación, no fue posible determinar su patrón de expresión por inmunohistoquímica. La inducción de estrés no alteró la expresión de ninguna de las isoformas. Por otro lado, mientras que STT3-A se expresa en glándulas y epitelio del útero en las dos cruzas, STT3-B se expresa en el endotelio vascular de la decidua de la cruza de alta tasa de resorción fetal. La exposición a ultrasonido indujo la expresión de STT3-B en el epitelio del útero de la cruza de baja tasa de resorción fetal. En cambio, en la cruza de alta tasa de resorción fetal se observó una inducción de la expresión de STT3-B y una disminución en la expresión de STT3-A en el epitelio del útero por causa del estrés. Considerando el rol que podría tener en gestación el sistema de L-selectina y la regulación de su funcionalidad por glicosilación, evaluamos la expresión de ligandos de L-selectina en los modelos planteados. Si bien detectamos la expresión de los ligandos de L-selectina por western blot en sitios de implantación de las dos cruzas de ratones estudiadas, no fue posible determinar su patrón de expresión por inmunohistoquímica. Luego observamos, que el estrés por ultrasonido generó un incremento en la expresión de estos ligandos en ambas cruzas. En esta Tesis documentamos un rol novedoso de P4 en el campo de la glicobiología. Demostramos que la expresión de las isoformas de OST puede ser regulada tanto in vitro como in vivo. In vitro hemos descrito una segunda isoforma de UGGT en ratón. Luego, observamos también una regulación de la expresión de las isoformas de UGGT in vitro, pero será necesario plantear otro modelo experimental para poder determinar si estas enzimas pueden ser reguladas in vivo. Además, detectamos en el hibridoma diferentes vías de regulación de la glicosilación de la IgG sintetizada. Entre estos mecanismos describimos la importancia de la cooperación entre las isoformas de STT3. Considerando que la adherencia del blastocito al epitelio uterino y la subsiguiente invasión del trofoblasto inducen cambios vigorosos en la interacción célula-célula y matriz extracelular del epitelio uterino, la regulación en la expresión de las isoformas de STT3 observada in vivo sugiere algún tipo de relación entre la expresión de las isoformas de OST y las glicoproteínas que intervienen en la implantación y progreso de la gestación.
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Palabras Clave
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