Caracterización de la interacción entre el anticonvulsivo Lamotrigina y el Receptor de Acetilcolina Nicotínico.

Tesis

Resumen *

El objetivo de este trabajo de Tesis fue estudiar si la droga anticonvulsiva Lamotrigina (6-(2,3-diclorofenil) 1,2,4-triazina-3, 5-diamina) interacciona con el AChR. Tal objetivo se asienta en el hecho que tanto el epifenómeno de la activación del AChR (luego de la unión con su ligando) es la permeación del Na+, al igual que el blanco farmacológico de la Lamotrigina (LTG), explotado en terapéutica. En una primera etapa, estudiamos mediante la técnica electrofisiológica de patch-clamp si la LTG interacciona de forma directa con el AChR muscular. Elegimos este subtipo de AChR por ser el mejor caracterizado y por ser el prototipo de la familia de receptores nicotínicos. Efectivamente, al exponer las células CHO-K1/A5, que expresan AChR muscular adulto (Roccamo et al., 1999) a la droga LTG (50-400 M), pudimos comprobar que la LTG interacciona con los AChRs, ejerciendo un efecto bloqueador de canal abierto cuando es co-aplicada con el agonista natural ACh (1 M). Dicho efecto es proporcional a la concentración de LTG aplicada. En una segunda etapa, analizamos si la LTG ejercía efectos a nivel celular, específicamente si la droga afectaba la morfología y/o la supervivencia celular. Al comparar las células CHO-K1/A5 incubadas en presencia de LTG con respecto a las células control, en ausencia de la droga, comprobamos que no se afecta la morfología celular en presencia del anticonvulsivo. Mediante la técnica de MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5 difeniltetrazol, que permite estudiar cambios en la viabilidad celular, observamos que la presencia de LTG protegía a las células CHO-K1/A5 de la muerte celular frente a un estimulo nocivo, como es la ausencia de suero en los medios de cultivo. En cambio, las células parentales CHO-K1, que carecen de AChR, no se benefician de tal protección. Estos resultados sugieren que la droga LTG ejerce algún otro tipo de efecto sobre los AChRs. Un simple bloqueador de canal abierto no podría ejercer este efecto en ausencia de agonista que mediara la apertura previa del canal. En el segundo Capítulo de esta Tesis, nuevamente recurrimos a técnicas electrofisiológicas para describir que en ausencia de agonista alguno, la LTG produce la activación del canal iónico. Estos resultados se complementan con estudios farmacológicos realizados por medio de la técnica de ligazón de I125 unido a la -bungarotoxina (-BTX), antagonista cuasi-irreversible del AChR, y estudios adicionales de microscopía de fluorescencia y fluorescencia en cubeta. El Capítulo 3 de esta Tesis tuvo como objetivo la obtención de un sistema celular de mamífero que expresase en forma estable a los 7 AChRs neuronales funcionalmente intactos en su superficie, con miras a futuros estudios farmacológicos sobre receptores del SNC. Obviamente, el requisito indispensable para tal fin es contar con expresión estable del 7 AChR. En el laboratorio se intentaron varias estrategias para intentar aumentar el nivel de expresión en membrana celular del 7 AChR (re-transfección de células en forma transiente con la subunidad 7, inducción del aumento de expresión con nicotina o con incubaciones a 25oC) (Schroeder et al., 2003) en células SHE-P1-h7. Dichas células expresan en forma estable al AChR neuronal 7 (Peng et al., 1999), y aunque si bien unen -BTX, su nivel de expresión en membrana es excesivamente bajo para su detección por técnicas de microscopía de fluorescencia o por técnicas electrofisiológicas de canal único. Es por ello que se recurrió a la tranfección de dichas células con la proteína Ric-3. Esta proteína, descubierta inicialmente en Caenorhabditis elegans (Williams et al., 2005), es requerida para la maduración de los AChRs en células que expresan endógenamente al AChR. Además se ha informado que la proteína Ric-3 homóloga humana aumenta la expresión de los 7 AChR en ovocitos de Xenopus laevis (Castillo et al., 2005). Efectivamente, a las 48 hs de tranfectar las células con el ADNc de la proteína Ric-3 pudimos observar por técnicas citoquímicas la expresión del 7 AChR en la superficie de las células SHE-P1-h7. Dado el caracter transiente de dicha expresión, se obtuvo subsecuentemente una línea celular que expresa al 7 AChR neuronal en forma permanente, obteniéndose un clon denominado SHE-P1-h7-Ric3. Con esta nueva herramienta celular realizamos estudios farmacológicos y electrofisiológicos para caracterizarla. En el futuro se piensa estudiar posibles interacciones de LTG con el 7 AChR en esta línea celular. Información suministrada por el agente en SIGEVA