PARTICIPACIÓN DE LA PROTEÍNA DE GOLPE DE CALOR Hsp70 Y DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN Nrf2 EN LA PROTECCIÓN CELULAR DURANTE LA NEFROPATÍA OBSTRUCTIVA NEONATAL

Tesis

Resumen *

PARTICIPACIÓN DE LA PROTEÍNA DE GOLPE DE CALOR Hsp70 Y DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN Nrf2 EN LA PROTECCIÓN CELULAR DURANTE LA NEFROPATÍA OBSTRUCTIVA NEONATAL RESUMEN La nefropatía obstructiva congénita es la principal causa de falla renal crónica en neonatos y niños de corta edad. La obstrucción renal inducida en animales de experimentación, es un modelo de fibrogénesis muy precoz y de rápida evolución. Además, el riñón en desarrollo es más susceptible que el riñón adulto a la injuria por obstrucción, a la progresiva infiltración intersticial característica de la nefropatía obstructiva del adulto, se le adiciona al riñón inmaduro, un defecto en el desarrollo y en el crecimiento renal, generado por la reducción en la proliferación celular y el incremento de la apoptosis. En la injuria obstrucción, el estrés oxidativo cumple un rol crítico en la pérdida permanente de la integridad funcional y estructural del riñón. El incremento en la presión hidrostática tubular y el estiramiento mecánico de las células del epitelio, como consecuencia de la hidronefrosis y los cambios en la osmolaridad, hipoxia e inflamación, se cree que son factores tempranos de estrés que conducen a la lesión de las células tubulares. Estos eventos promueven la inflamación, fibrosis, apoptosis y necrosis. El grado de estrés y la severidad de la fibrosis renal, dependen de un desequilibrio entre la producción excesiva de ERO y los mecanismos de defensa que posee el riñón. El aumento de ERO induce la activación de factores de transcripción redox‐sensibles y las vías de transducción de señales que restauran el equilibrio. Para contrarrestar los efectos deletéreos del estrés y el daño celular, los organismos han desarrollado diversas estrategias de defensa que contemplan la expresión de proteínas de estrés, como las Hsp (Heat Shock Proteins) y enzimas antioxidantes. Las Hsp pueden expresarse de forma constitutiva o inducirse por diversos estresores, en especial Hsp70 confiere protección celular mediante la modulación e inhibición del proceso de apoptosis. Además, las ERO activan las vías de citoprotección, mediante un mecanismo de defensa regulado por el factor de transcripción Nrf2. En condiciones de homeostasis, este factor de transcripción se encuentra anclado en el citoplasma por una proteína inhibitoria denominada Keap1. En condiciones de estrés oxidativo, Nrf2 se libera de Keap1 y se transloca al núcleo donde coordina la regulación positiva de números genes antioxidantes. En este trabajo de tesis, se utilizan dos modelos experimentales, uno de ratas neonatas sometidas a OUU (Obstrucción Ureteral Unilateral) y otro en cultivo de células epiteliales tubulares proximales renales humanas, de la línea HK2 (Human Kydney 2), sometidas a DMC (Deformación Mecánica Celular) y tratamientos con H2O2, utilizados como inductores del estrés oxidativo. En ambos modelos se evaluará la participación del factor de transcripción Nrf2, su inhibidor la proteína Keap1 y dos de sus productos de activación, las enzimas antioxidantes GSTA2 y NQO1. Además, paralelamente se estudian las proteínas de estrés Hsp70 y Hsp25, en la modulación del estrés oxidativo durante la evolución temporal frente a los estímulos estresores nombrados. En el modelo experimental animal: se utilizan ratas neonatas de la cepa Wistar a las cuales se les practica la obstrucción mecánica en el uréter izquierdo y se utilizan como controles animales sin obstrucción, luego todos son nefrectomizados a los 5, 7, 10 y 14 días y se obtienen muestras de corteza de riñones controles (RC) sin OUU, riñones obstruidos (RO) y sus respectivos riñones contralaterales (RCL). En el modelo experimental celular: se utilizan células HK2 replicadas en placas de silicona, se someten a DMC a distintos intervalos de tiempo y se utilizan controles sin deformación. Posteriormente, las células se despegan y se obtienen muestras de controles sin deformación (CSD), y deformadas por 1, 2, 4 y 6 horas (CD1, CD2, CD4 y CD6) respectivamente. En las muestras obtenidas de ambos modelos, se evalúan la participación del complejo de NADPH oxidasa y la actividad antioxidante total (AAT); la activación de la vía Nrf2, la inducción de las enzimas antioxidantes y la expresión de las proteínas de estrés. Los resultados en el modelo animal muestran que durante la obstrucción temprana de 5 a 7 días, existe una disminución de los marcadores de estrés oxidativo, asociado con niveles significativamente elevados de Hsp72, fracción inducible de Hsp70, rápida acumulación nuclear de Nrf2, regulación negativa de Keap1 en el citosol e inducción de los ARNm de enzimas antioxidantes GSTA2 y NQO1. Por el contrario, luego de 10 y 14 días de obstrucción, se observa incremento significativo de la peroxidación de lípidos con elevados niveles de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). El aumento de estrés oxidativo resulta en una reducción de la AAT e incremento en la actividad enzimática del complejo de NADPH Oxidasa. Paralelamente se observa una disminución significativa en la expresión de Hsp72, y una reducción progresiva de Nrf2 nuclear y dos de sus productos génicos NQO1 y GSTA2, mientras que el inhibidor Keap1, se encuentra aumentado. Estos resultados demuestran la participación del estrés oxidativo y la activación de los mecanismos de citoprotección durante la nefropatía obstructiva temprana, posteriormente debido a la persistencia de la obstrucción y a la disminución de las vías de citoprotección, se observa un incremento del estrés oxidativo y la peroxidación de lípidos. Los resultados obtenidos en células HK2 demostraron un incremento significativo en la actividad de NADPH Oxidasa luego de 1 y 2 horas de deformación mecánica, acompañado de una disminución significativa de la AAT y un posterior incremento de Hsp70 como mecanismo de citoprotección temprana. Luego de 4 y 6 horas de deformación mecánica el estrés oxidativo disminuye significativamente como consecuencia de la activación de Nrf2 y el subsecuente incremento de GSTA2, como mecanismo citoprotector secundante. Resultados similares fueron obtenidos estimulando las células con H2O2 a iguales tiempos y la participación de Hsp70 quedó confirmada en células silenciadas para esta vía. Estos resultados sugieren que la magnitud de citoprotección durante la obstrucción temprana depende de la contribución conjunta: de la respuesta de Hsp70 y de su fracción inducible Hsp72; y de la activación inducida de Nrf2 y sus productos de activación, las enzimas GSTA2 y NQO1. Por el contrario, en la obstrucción prolongada, se observa un deterioro en la capacidad de respuesta biológica al estrés oxidativo, que conducen a la injuria renal. De acuerdo a los resultados obtenidos, se concluye que la proteína de golpe de calor Hsp70 y la vía del factor de transcripción Nrf2, ejercen un efecto citoprotector coordinado contra el estrés oxidativo durante la nefropatía obstructiva neonatal temprana Información suministrada por el agente en SIGEVA