Estudio de la expresión y función de los genes Hox y su regulación por ácido retinoico durante el desarrollo embrionario del Xenopus laevis

Tesis

Resumen *

La homeobox (hbx) es una secuencia de 180 nucleótidos que codifica un dominio proteico de 60 aminoácidos, el homeodominio, capaz de unirse al DNA. Las proteínas que lo poseen son nucleares y actúan como factores reguladores de la transcripción. Los genes selectores homeóticos de Drosophila melanogaster constituyen una clase de genes que contienen hbx. Se ordenan en complejos y determinan la identidad de los segmentos de la mosca, porque proveen información posicional en el eje anterior-posterior (A-P) del embrión. La mutación de uno de estos genes determina que un segmento se transforme en otro distinto (transformación homeótica). En los vertebrados, estos genes están conservados con respecto a la secuencia, el ordenamiento en los complejos y el patrón espacial y temporal de expresión embrionaria, y se denominan genes Hox. Su anulación o sobreexpresión en ratones transgénicos produce en general transdeterminaciones vertebrales. Estas observaciones sugieren que los genes Hox también proveen información posicional en el eje A-P de los vertebrados (revisado por McGinnis y Krumlauf, 1992). El ácido retinoico (RA) es capaz de regular a los genes Hox en cultivos celulares (Boncinelli y col., 1991) y se encuentra en los embriones de Xenopus laevis (Durston y col., 1989). El tratamiento con RA altera profundamente la regionalización A-P de los embriones de Xenopus (Durston y col., 1989). Por lo tanto, los genes Hox constituyen excelentes candidatos como blancos de la acción del RA, y como mediadores de las alteraciones que éste produce en el eje céfalo-caudal. El primer objetivo de este trabajo fue estudiar el patrón espacial y temporal de expresión de los productos de dos genes Hox, las proteínas XlHoxc-6 y XlHoxb-7, durante el desarrollo embrionario normal de Xenopus laevis. Se generaron anticuerpos contra proteínas recombinantes, y los productos de los genes embrionarios se detectaron por inmunohistoquímica. Las proteínas XlHoxc-6 y XlHoxb-7 establecen dominios de expresión restringidos en el eje A-P, como corresponde a los genes Hox y a determinantes de información posicional. Ambas se expresan en el sistema nervioso central (SNC), en territorios yuxtapuestos y parcialmente superpuestos, con límites anteriores bien definidos. XlHoxb-7 predomina en el romboencéfalo caudal y XlHoxc-6, en la región cervical de la médula espinal. También se expresan en células dispersas en los flancos del embrión (posiblemente derivadas de las crestas neurales) y en estructuras cuyas posiciones se correlacionan con los correspondientes dominios de expresión en el SNC. En particular, XlHoxb-7 es muy abundante en el complejo ganglionar craneano IX-X y en los arcos branquiales posteriores, estructuras que reciben la contribución de células de las crestas neurales (CCN) de la corriente migratoria branquial post-ótica y vagal, que parten del nivel del romboencéfalo caudal. En segundo lugar, nos propusimos investigar si el RA era capaz de regular in vivo a los genes Hox, y si las alteraciones fenotípicas producidas por los tratamientos con RA se correlacionaban con cambios en el patrón de expresión de homeoproteínas. A su vez, esta aproximación podía aportar evidencias sobre las posibles funciones del RA endógeno y de los genes Hox en el proceso de regionalización A-P en los vertebrados. Con ese fin, se trataron embriones de Xenopus con RA de acuerdo con el protocolo de Durston y col. (1989) y se estudiaron los efectos sobre la expresión de las proteínas XlHoxc-6 y XlHoxb-7 por inmunohistoquímica. El RA produce pérdidas progresivas de las estructuras anteriores y es capaz de modificar la localización de ambas homeoproteínas en el eje A-P, en forma dependiente de la concentración. Produce un desplazamiento cefálico progresivo del límite anterior del dominio XlHoxb-7 que se correlaciona con una expansión cefálica de la séptima rombómera y una compresión y/o pérdida de las rombómeras pre-óticas. En general no afecta el dominio normal de XlHoxc-6, pero en la máxima concentración utilizada (10 M) desplaza caudalmente su límite posterior, y la dosis 1 M lo activa ectópicamente en el cerebro anterior. El tercer objetivo fue estudiar el rol de los retinoides endógenos durante el desarrollo embrionario temprano y en particular, averiguar si el RA endógeno era necesario para regular la expresión de proteínas Hox in vivo. Para ello, se trataron embriones de Xenopus y de pollo con un antagonista del RA capaz de unirse al RAR con mayor afinidad, y al RAR con menor afinidad, y se procesaron para inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-XlHoxb-7. El tratamiento de embriones de Xenopus laevis con el antagonista Ro 41-5253 antes o durante la gastrulación inhibe progresivamente la expresión de la proteína XlHoxb-7 y produce malformaciones de los derivados de las tres capas germinales en forma dependiente de la dosis. En los embriones de pollo, el tratamiento con el antagonista durante la gastrulación produce una pérdida o desplazamiento caudal del domino Hoxb-7 y en algunos casos, una activación ectópica del gen en el proceso cefálico. Los resultados indican que en los embriones de vertebrados, el tratamiento con RA altera la regionalización del eje A-P mediante la modificación en la expresión espacial de los genes Hox, y que ésta normalmente es regulada por retinoides endógenos. Se propone que durante la gastrulación se establece un gradiente A-P de actividad de retinoides endógenos que determina la secuencia céfalo-caudal de activación de genes Hox. Información suministrada por el agente en SIGEVA