Estudio de la regulación de la actividad ornitina descarboxilasa en hongos fitopatógenos

Tesis

Resumen *

Las poliaminas son compuestos alifáticos de bajo peso molecular que a pH fisiológico se encuentran protonadas y cargadas positivamente, lo que les permite interactuar con moléculas de carga neta negativa tales como ácidos nucleicos, fosfolípidos y proteínas. Se encuentran ampliamente distribuidas en todos los organismos y son esenciales para el desarrollo de los mismos. En el ambiente celular pueden hallarse libres, conjugadas a compuestos fenólicos o unidas a proteínas y ácidos nucleicos. En la mayoría de los hongos estudiados hasta el presente la única vía de biosíntesis de estos compuestos comienza con la descarboxilación de la ornitina. De esta manera, la ornitina descarboxilasa (ODC) (que cataliza esta primera reacción), se convierte en una enzima clave del crecimiento y desarrollo de los mismos y en consecuencia ha sido intensamente estudiada. A su vez, las plantas poseen una ruta alternativa de producción de poliaminas que comienza con la descarboxilación de arginina por medio de la arginina descarboxilasa (ADC). Se ha propuesto entonces que el uso de inhibidores de la ODC podría ser una estrategia de control de este tipo de patógenos, ya que el hongo sería incapaz de sintetizar poliaminas que le permitan sobrevivir y la planta conservaría activa la vía de la ADC y no resultaría perjudicada. Ustilago maydis es un hemibasidiomicete responsable de la enfermedad del carbón del maíz. El desarrollo de sus tumores sobre las espigas de la planta produce pérdidas económicas importantes en diversos lugares del mundo y, a su vez, en México estos mismos tumores son considerados un ingrediente irreemplazable de platos tradicionales. Además ha sido seleccionado como hongo modelo en estudios moleculares. Con el objeto de ampliar nuestro conocimiento sobre el rol desempeñado por las poliaminas en la transición dimórfica de U. maydis, en el presente estudio se determinó que, el proceso está acompañado por un aumento significativo en la actividad ODC. En correspondencia, el contenido de putrescina (PUT) acompañó este aumento de actividad enzimática, mientras que los niveles de espermidina (ESPD) sólo tuvieron una leve tendencia de aumento y los de espermita (ESPM) disminuyeron hasta valores cercanos al límite de detección. Por otro lado, se trató de clonar la secuencia que codifica para síntesis de la ODC de U. maydis en un vector de expresión adecuado. Lamentablemente no se obtuvieron transformantes con dicho constructo. En el apartado correspondiente se discuten las posibles causas que imposibilitaron la obtención de bacterias transformadas y las alternativas metodológicas que nos propondremos emplear para cumplir con dicho objetivo. Sclerotinia sclerotiorum es un hongo fitopatógeno sumamente polífago y en nuestro país es uno de los principales patógenos del girasol cultivado, y su permanencia en los campos afectados se ve facilitada por la formación de ciertas estructuras de resistencia denominadas esclerocios. En el presente trabajo se estudiaron los cambios en los contenidos de poliaminas y actividades enzimáticas durante la formación de estas estructuras de resistencia. En particular, se observó que las actividades ODC y S-adenosilmetionina descarboxilasa (SAMDC) y los contenidos de ESPD y ESPM disminuyeron progresivamente durante este proceso de diferenciación. En cambio, la concentración de PUT disminuyó en los primeros estadios del desarrollo pero aumentó hacia el final de la maduración. Este aumento no pudo ser explicado por incremento de la síntesis de novo de PUT, por lo que otros procesos metabólicos que modulan los niveles de esta diamina serían los responsables de tal incremento. Entre los mismos se incluirían el pasaje de PUT a su forma libre a partir de su forma conjugada y/o la disminución de su degradación por medio de diamino oxidasa (DAO) o de un proceso de interconversión de ESPM en ESPD catalizado por la poliamina-oxidasa (PAO) y una posible influencia de este proceso sobre los niveles de la diamina, y/ó las enzimas que regulan sus concentraciones. El crecimiento de micelio y la formación de esclerocios fue severamente reducida por la presencia de difluorometil ornitina (DFMO) -un inhibidor irreversible de la ODC- en concentración 1 mM. Utilizando concentraciones menores del mismo inhibidor sólo se vio afectado el crecimiento del micelio. Esto indicaría que el proceso de formación de esclerocios posee una menor dependencia de las concentraciones de poliaminas con respecto a las necesarias para sostener el crecimiento del micelio. En consonancia con esta hipótesis, otros inhibidores como la ciclohexilamina (CHA) y la metilglioxal-bis-guanilhidrazona (MGBG) –inhibidores reversibles de la espermidina sintasa (ESPDsint) y SAMDC respectivamente- no afectaron el desarrollo de estas estructuras de resistencia. Información suministrada por el agente en SIGEVA