Empleo de vísceras de Pygocentrus nattereri para la obtención de enzimas proteolíticas de interés industrial

Producción CyT

Tesis

Autoría

MEDINA, DAIANA MAILEN

Fecha

01/06/2026

Resumen Información suministrada por el agente en SIGEVA

Desde la Revolución Industrial, el modelo económico lineal ha impulsado un cambio ambiental crítico, agotando recursos y acelerando la crisis climática. Ante este escenario, surge la bioeconomía circular como una respuesta indispensable que integra la reutilización de materiales con el aprovechamiento sostenible de recursos biológicos en ciclos cerrados, promoviendo la regeneración de ecosistemas y garantizando la seguridad alimentaria fre... Desde la Revolución Industrial, el modelo económico lineal ha impulsado un cambio ambiental crítico, agotando recursos y acelerando la crisis climática. Ante este escenario, surge la bioeconomía circular como una respuesta indispensable que integra la reutilización de materiales con el aprovechamiento sostenible de recursos biológicos en ciclos cerrados, promoviendo la regeneración de ecosistemas y garantizando la seguridad alimentaria frente al hambre crónica. En este contexto, el sector acuícola se ha consolidado como estratégico. Sin embargo, enfrenta el problema estructural de la pérdida y desperdicio de alimentos, ya que hasta un 70% del pescado procesado se convierte en subproductos como vísceras, escamas, piel y huesos.Para mitigar este impacto, la "Transformación Azul" promovida por la FAO impulsa la valorización de estos residuos en biomoléculas de alto valor comercial. Aunque estas estrategias suelen aplicarse a especies comerciales consolidadas, el estudio de recursos biológicos nativos subutilizados, como la palometa (Pygocentrus nattereri), adquiere una relevancia fundamental. Este pez, ampliamente distribuido en las cuencas del Paraná, Paraguay y Uruguay, ofrece una oportunidad estratégica para generar biomasa sostenible y obtener biomoléculas industriales a partir de sus vísceras.Dentro de este marco, las proteasas juegan un rol central por su capacidad para catalizar procesos biotecnológicos de manera eficiente. Las enzimas derivadas de la palometa, como la pepsina (ácida) y la tripsina (alcalina), presentan ventajas distintivas como una alta eficiencia a bajas temperaturas. La organización anatómica de P. nattereri, con un estómago bien desarrollado y ciegos pilóricos funcionales, facilita la obtención localizada de estos biocatalizadores, permitiendo transformar descartes de bajo costo en herramientas de alto valor agregado.Otra biomolécula de interés es el colágeno, donde los subproductos acuáticos son una fuente esencial de esta proteína estructural, abundante de la matriz extracelular. Frente a las fuentes convencionales (bovina y porcina), que presentan riesgos de zoonosis y restricciones religiosas, el colágeno de peces de agua dulce emerge como una alternativa superior. A diferencia del colágeno marino, que posee baja estabilidad térmica, el de agua dulce presenta temperaturas de desnaturalización intermedias (28-33 °C), lo que aumenta su competitividad tecnológica en las industrias farmacéutica y cosmética.Por lo tanto, el éxito de estas aplicaciones depende de la eficiencia en la obtención de biomoléculas con el grado de pureza adecuado. La creciente necesidad de procesos bioseparativos escalables y selectivos ha impulsado el desarrollo de protocolos basados en cromatografía de columna y sistemas bifásicos acuosos (SBA). Estas estrategias permiten purificar enzimas proteolíticas y colágeno sin comprometer su sensibilidad estructural, consolidando así un modelo de desarrollo sostenible que transforma los límites ambientales en oportunidades de innovación biotecnológica regional.En este trabajo se obtuvo por un lado la obtención de un extracto crudo de ciegos pilóricos con una concentración proteica de 3,31 mg/mL. Mediante una única etapa de purificación por cromatografía de afinidad (Benzamidina–Sepharose 6B), se logró aislar un pico de alta pureza (P-III) con una actividad específica de 0,08 U/mg. El análisis por SDS-PAGE confirmó la eficacia del proceso, revelando una banda definida de aproximadamente ~23 kDa, peso consistente con las tripsinas de peces. El análisis proteómico por nano-HPLC-MS/MS identificó la presencia de enzimas pancreáticas (Carboxipeptidasas, Alfa-amilasa) y una matriz dominante de colágeno, validando el origen tisular de la muestra.La enzima del tipo tripsina (ET) demostró una cinética eficiente sobre el sustrato BAPNA, con un Km de 0,181 mM y un kcat de 0,040 s⁻¹. Como es característico de las serinas proteasas, su actividad fue máxima en medios alcalinos (pH óptimo de 9,0) y se inhibió completamente con SBTI, mientras que la pepstatina A no mostró efectos significativos. Estructuralmente, los estudios de fluorescencia nativa (pico en 345 nm) indicaron que los valores extremos de pH y las altas temperaturas provocan una desestabilización severa de la proteína, lo que correlaciona con la pérdida de su capacidad catalítica.En cuanto a su comportamiento térmico, la enzima alcanzó su actividad máxima a 55 °C, aunque su estabilidad se ve comprometida en exposiciones prolongadas, sufriendo una desnaturalización irreversible por encima de los 60 °C. Respecto al pH, mostró una notable robustez, conservando más del 90% de su actividad entre pH 7,0 y 10,0. Para su conservación a largo plazo, se determinó que el almacenamiento a −20 °C es el más adecuado, manteniendo un 88% de actividad residual frente al deterioro observado a 4 °C.La versatilidad de la ET se evidenció en tres ensayos clave, mantuvo una elevada estabilidad frente a surfactantes no iónicos y jabones comerciales (Ala® y Skip®), sugiriendo su potencial para formulaciones industriales. Logró una degradación completa de las fracciones de caseína en apenas 15 minutos, demostrando una alta eficiencia proteolítica. En ensayos con la línea celular C6, la ET promovió el redondeamiento y desprendimiento de la monocapa celular con una eficacia estadísticamente comparable a la tripsina comercial, posicionándose como una alternativa biotecnológica viable para la manipulación de cultivos adherentes.Por otro lado, mediante la disgregación de la mucosa gástrica se procedió a la obtención de un extracto crudo (ECmg) con una concentración proteica de 8,55 mg/mL y una actividad específica de 46,53 U/mg. Mediante cromatografía de intercambio iónico (DEAE–Sepharose), se aisló un pico de alta pureza (P-IV) que alcanzó una actividad específica de 381,31 U/mg, con un factor de purificación de 8,20 y un rendimiento del 57%. El análisis por SDS-PAGE confirmó la purificación al mostrar una banda predominante de aproximadamente ~38 kDa, valor coincidente con los pepsinógenos reportados en otras especies de peces.La enzima del tipo pepsina (EP) demostró una alta afinidad por el sustrato hemoglobina (Hb), con un Km de 7,77 µM y una constante catalítica (kcat) de 0,71 s⁻¹. Como proteasa aspártica típica, su actividad fue máxima en condiciones de marcada acidez, con un pH óptimo de 3,0, manteniendo niveles elevados de actividad entre pH 1,0 y 2,0. Su naturaleza fue confirmada mediante ensayos de inhibición: la pepstatina A anuló completamente su actividad de forma dosis-dependiente, mientras que el inhibidor de tripsina (SBTI) no produjo efecto alguno.La enzima presentó su temperatura óptima a 55 °C, aunque mostró signos de desnaturalización térmica inmediata por encima de los 60 °C. En cuanto a la estabilidad al pH, la EP resultó ser muy robusta en medios ácidos (pH 1,0 a 3,0), pero perdió su funcionalidad de forma abrupta al superar el pH 5,0, siendo casi inactiva en medios alcalinos. Para su preservación, el almacenamiento en freezer (−20 °C) resultó ser el método más eficaz para mantener la estabilidad proteolítica tras la liofilización.Los espectros de fluorescencia nativa revelaron un pico de emisión en 355 nm, indicando una estructura estable en condiciones ácidas. Sin embargo, el pH fuertemente alcalino (pH 12,0) y las temperaturas superiores a 60 °C provocaron un colapso conformacional irreversible. Por otro lado, el análisis proteómico (nano-HPLC-MS/MS) presentó desafíos debido a la falta de secuencias de referencia completas para esta especie en las bases de datos mundiales, lo que sugiere que la EP de la palometa posee una secuencia pro-enzimática aún no reportada.En cuando a su aplicabilidad, la EP mostró una capacidad de hidrólisis superior a la de la pepsina porcina comercial en ensayos de difusión en agar-gelatina, generando halos de degradación de mayor diámetro tras 12 y 24 horas. Además, demostró una potente capacidad para hidrolizar anticuerpos. Tras solo 5 minutos de incubación, se observó una degradación significativa de la banda de 150 kDa, alcanzando una hidrólisis casi completa a los 60 minutos, dejando únicamente fragmentos de bajo peso molecular (~28 kDa). Los Sistemas Bifásicos Acuosos (SBA) constituidos por polietilenglicol (PEG) y citrato de sodio (NaCit), potenciados con líquidos iónicos (LI), se consolidan como una estrategia de separación altamente eficiente y selectiva para la purificación de proteasas de la palometa. El comportamiento de estos sistemas está regido por una compleja interdependencia entre el pH, el peso molecular del polímero y la naturaleza del líquido iónico, factores que determinan la amplitud de la región bifásica y la eficiencia del reparto.El estudio de los diagramas binodales reveló que el incremento del pH de 5,0 a 8,0 favorece la separación de fases debido a la desprotonación del citrato, lo que potencia el efecto salting-out y expande la región bifásica. Asimismo, el aumento en la masa molecular del polímero (de PEG 2000 a 6000) reduce el área de miscibilidad por el mayor volumen excluido de las cadenas. En cuanto a los líquidos iónicos, el [EMIM]Cl (con cadena alquílica más corta) demostró ser más eficiente que el [BMIM]Cl, permitiendo la formación de fases a concentraciones de solutos más bajas y promoviendo una segregación de componentes más efectiva.El potencial de los SBA para procesos separativos se confirmó mediante el análisis de los coeficientes de reparto (Ke y Kp) y la selectividad (S), donde ET mostró una partición preferencial hacia la fase superior rica en polímero (Ke > 1). El sistema más eficiente fue PEG 4600/[EMIM]Cl, que alcanzó la mayor selectividad (9,99). El análisis por SDS-PAGE confirmó que la enzima de ~23 kDa se concentra en la fase superior, mientras que los contaminantes de alto peso molecular se desplazan a la fase inferior.Por el contrario, EP presentó una sensibilidad mucho mayor a las variaciones del sistema. El sistema PEG 4600/[BMIM]Cl destacó con una elevada selectividad de 36,56, logrando concentrar selectivamente los pepsinógenos (35-42 kDa) en la fase superior y desplazando la mayoría de las proteínas contaminantes hacia la fase enriquecida en sal.El estudio del colágeno soluble en ácido (ASC) extraído de la piel de Pygocentrus nattereri demostró que este residuo pesquero es una fuente valiosa de biomateriales con alta integridad estructural y funcional. Con un rendimiento del 1,86% y un grado de pureza del 42,1%, el material obtenido conserva las características nativas necesarias para aplicaciones biotecnológicas, destacándose por su estabilidad y bioactividad.El análisis mediante SDS-PAGE confirmó que se trata de colágeno tipo I, compuesto por las cadenas α1 y α2 (~110-120 kDa), además de formas polimerizadas (β y γ), lo que evidencia la preservación de su estructura molecular. Esta integridad fue ratificada por dos técnicas complementarias, por un lado la relación de bandas Amida III/A1450 de 0,86 confirmó la conservación de la conformación de triple hélice nativa, demostrando que el método de extracción y liofilización no afecta su integridad. Además, se determinó una temperatura de desnaturalización (Td) de 32,5 °C, un valor competitivo para colágenos de agua dulce que supera a los de origen marino, permitiendo su uso en rangos térmicos más amplios.Se evaluó la interacción entre la EP de la misma especie y el colágeno extraído, donde se demostró una potente capacidad catalítica de la enzima, logrando una hidrólisis casi completa del colágeno tras 24 horas y generando péptidos de bajo peso molecular ( ≤53 kDa). Esta fragmentación resultó estratégica, ya que el hidrolizado de colágeno alcanzó una capacidad antioxidante superior (83,39%) en comparación con el colágeno nativo, debido a la mayor exposición de grupos funcionales en los péptidos pequeños.El colágeno de la palometa mostró un desempeño sobresaliente como biomaterial en ensayos de organización endotelial. Al ser utilizado como hidrogel para el cultivo de células endoteliales (tEnd.1), indujo cambios morfológicos significativos y la formación de estructuras tipo capilar.En conclusión, los hallazgos de esta investigación permiten afirmar que las biomoléculas obtenidas a partir de los subproductos de Pygocentrus nattereri constituyen recursos biotecnológicos de alto valor y versatilidad, cuya integración en procesos de purificación avanzados demuestra que es posible transformar residuos biológicos en herramientas industriales de precisión. El estudio reveló que tanto la tripsina (ET) como la pepsina (EP) de la palometa poseen propiedades catalíticas y estabilidades competitivas frente a sus contrapartes comerciales, destacándose el desarrollo de protocolos de purificación de etapa única mediante Sistemas Bifásicos Acuosos (SBA) optimizados con líquidos iónicos. La capacidad de modular el reparto enzimático mediante variables como el pH y el peso molecular del polímero permite obtener biocatalizadores con alta selectividad de manera escalable y económica, sentando las bases para un aprovechamiento integral bajo el marco de la bioeconomía circular.Simultáneamente, el colágeno soluble en ácido (ASC) extraído de la piel se posiciona como una alternativa estratégica a las fuentes bovina, porcinas y marinas convencionales, gracias a una estabilidad térmica intermedia (Td = 32,5 °C) y la preservación de su estructura de triple hélice nativa. Su capacidad para inducir organización endotelial y el incremento de su bioactividad antioxidante tras la hidrólisis enzimática abren un abanico de posibilidades en la ingeniería de tejidos y la biomedicina.En última instancia, la valorización de la palometa trasciende el ámbito técnico para ofrecer una solución a la gestión ineficiente de descartes pesqueros, reduciendo el impacto ambiental y fomentando la innovación local en contextos de volatilidad macroeconómica. Al convertir vísceras y piel en productos de alto valor agregado, esta tesis materializa un modelo de desarrollo sostenible que armoniza la productividad económica con la responsabilidad ambiental, transformando definitivamente un desecho en una oportunidad tecnológica estratégica para la región.

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Palabras Clave

BiomoléculasPurificaciónPygocentrus nattereri