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Libro de resúmenes - Optimización de cultivos monocapas de células oviductales para evaluar el efecto del folato en la funcionalidad celular
Congreso
Fecha:
2025Editorial y Lugar de Edición:
Universidad Catolica de SaltaResumen *
INTRODUCCIÓNLos epinutrientes son un subconjunto de nutrientes esenciales para el funcionamiento y la maquinaria epigenética celular. Se ha demostrado que tienen relevancia en diferentes eventos reproductivos y entre ellos se encuentra el folato, un epinutriente esencial que juega un papel crucial en diferentes procesos celulares tales como la biosíntesis de ácidos nucleicos, el metabolismo de aminoácidos y la regulación epigenética. A la hora de evaluar el efecto de este tipo de epinutrientes en la funcionalidad celular, resulta imprescindible poder contar con un modelo celular in vitro que sea de fácil estandarización y que garantice resultados fiables y reproducibles. Bajo este contexto, el modelo de monocapa bidimensional es ampliamente utilizado dado que permite estandarizar ensayos para la evaluación de indicadores claves de funcionalidad celular tales como la proliferación, viabilidad y migración. Sin embargo, la optimización de este sistema debe adaptarse al tipo celular específico con el que se trabaja, ya que diferentes tipos celulares presentan requisitos únicos en cuanto a sus condiciones de cultivo. En particular, las células epiteliales del oviducto bovino (BOECs) representan un modelo valioso para estudiar la funcionalidad de una región crítica del tracto reproductivo. Optimizar el cultivo de estas células permitirá disponer de un modelo para incrementar la comprensión de los factores que influyen en el ambiente oviductal. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo se centra en la optimización de un cultivo monocapa de células del epitelio oviductal, con el objetivo de evaluar el efecto del ácido fólico (forma sintética del folato) en la funcionalidad celular.MARCO TEÓRICOEl oviducto bovino desempeña un papel fundamental en el proceso reproductivo al proporcionar un microambiente especializado para el embrión en sus primeras etapas de desarrollo y las células que tapizan el lumen oviductal. Este órgano dinámico, además, modula las respuestas celulares ante diversos estímulos, convirtiéndolo en un órgano clave para el estudio de los eventos fisiológicos que ocurren en su interior (Li y Winuthayanon, 2017). En este contexto, las células epiteliales del oviducto bovino (BOECs, por sus siglas en inglés) desempeñan un papel crucial en la regulación de estos procesos, respondiendo a diversos estímulos presentes en el fluido oviductal y modulando activamente la fisiología celular. Para estudiar estos mecanismos, el modelo de cultivo in vitro en monocapa ha emergido como una herramienta valiosa. Este cultivo ofrece un sistema controlado y reproducible que permite investigar cómo factores específicos del microambiente, afectan la actividad celular. Entre ellos, el folato se destaca por su rol como epinutriente interviniendo en la síntesis de nucleótidos y en las reacciones de metilación, dos procesos fundamentales que regulan el funcionamiento celular.En base a los estudios de nuestro laboratorio, hemos logrado demostrar que el folato está presente en el fluido oviductal bovino y que su concentración fluctúa dependiendo de la etapa del ciclo estral, principalmente durante la etapa postovulatoria temprana (García et al., 2018). Asimismo, demostramos que las BOECs expresan receptores, transportadores y enzimas que son necesarias para el metabolismo de este epinutriente. Dicha expresión se ve anatómicamente y temporalmente regulada durante el ciclo estral y es modulada por los niveles de hormonas esteroideas y/o folato presente en el medio extracelular (Gomez et al., 2024; García et al., 2020 y 2018). Estos resultados sugieren que el folato podría ser clave para la funcionalidad de las células oviductales. A fin de contar con un modelo in vitro que permita evaluar la influencia del folato sobre la funcionalidad de las BOECs, en el presente trabajo se propuso: 1) Optimizar el proceso de obtención y cultivo de monocapas de células epiteliales del oviducto bovino; 2) Emplear dicho modelo de cultivo in vitro para evaluar el efecto del folato sobre la funcionalidad de las células oviductales, evaluando como parámetros la viabilidad, migración y proliferación celular.METODOLOGÍAObtención de muestras biológicas A partir de hembras bovinas faenadas, se procedió a la colecta de los tractos reproductivos completos. Mediante evaluación macroscópica de la morfología ovárica se seleccionaron aquellos tractos en etapa preovulatoria que presentaban un folículo prominente próximo a ovular. Posteriormente, se llevó a cabo al procesamiento de los oviductos, tanto ipsilateral como contralateral al ovario activo. En una caja de Petri, se realizó la limpieza de cada oviducto removiendo restos mesentéricos, tejido adiposo y vasos sanguíneos con ayuda de pinzas y bisturí. Por último, los oviductos fueron lavados 4 veces con PBS estéril suplementado con una solución comercial de antibióticos y antifúngicos (Gibco, producto 15240).Obtención de células epiteliales del oviducto bovino (BOECs)Una vez realizado el lavado, se procedió a la obtención de las BOECs sobre placa de Petri estéril. Para ello con un portaobjeto estéril, se realizó una suave presión mecánica sobre la pared externa del oviducto permitiendo la salida del contenido celular por uno de los extremos. Las células obtenidas fueron transferidas a un tubo de 15 ml y lavadas con PBS estéril suplementado con antibióticos y antifúngicos. Las mismas fueron cultivadas in vitro como se detalla a continuación. Cultivo in vitro en monocapaEl pellet de células obtenido fue transferido a una placa de cultivo de 60 mm conteniendo 5 ml de medio TCM-199 (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB, Internegocios), 25 mM de HEPES (Gibco), 0,2 mM de piruvato de sodio y 1% de la solución de antibióticos-antifúngicos (Gibco). Se procedió luego a la disgregación mecánica de las células realizando dos pasajes a través de una aguja 21G. La suspensión celular fue luego transferida a un tubo de 15 ml y se efectuaron dos lavados, cada uno seguido de una sedimentación de 15 min en estufa. Posteriormente, las células fueron cultivadas en placas de 60 mm conteniendo 5 ml de medio TCM-199 suplementado como se detalló anteriormente. El cultivo se mantuvo durante 6 a 7 días a 38,5 °C, con 5% de CO₂ y 100% de humedad, renovando el medio cada 48 h, hasta alcanzar una confluencia del 80-90%. Una vez que las células alcanzaron el porcentaje de confluencia indicado, se procedió a su disociación mediante tripsinización para desprenderlas de la placa de cultivo. Para ello, se eliminó el medio de cultivo y las monocapas celulares fueron sometidas a dos lavados con PBS estéril. A continuación, se añadió una solución de tripsina-EDTA 0,25% (Gibco) y se incubó a 37°C durante 5 min, hasta que las células comenzaron a desprenderse. El proceso fue detenido añadiendo medio de cultivo con SFB. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 min y resuspendidas en medio de cultivo para su recuento en cámara.Tras el recuento celular, se realizaron los cálculos necesarios para sembrar la concentración adecuada de células en placas de 24 pocillos, destinadas a los ensayos de viabilidad, proliferación e inhibición, y en placas de 35 mm para el ensayo de cierre de herida. Estimulación con ácido fólicoCon el objetivo de evaluar el efecto del ácido fólico sobre los cultivos monocapa de BOECs, se llevaron a cabo ensayos de estimulación con diferentes concentraciones. Los cultivos se mantuvieron en medio TCM-199 durante 24 h a 38,5 °C, con 5% de CO₂ y 100% de humedad, en presencia de concentraciones crecientes de ácido fólico (1, 10, 50 y 100 μM) o en medio sin suplementar (grupo control). Se realizaron un total de 3 réplicas experimentales para cada parámetro de funcionalidad.Evaluación de la viabilidad celularPara evaluar el efecto de las diferentes concentraciones de ácido fólico sobre la viabilidad de las BOECs se empleó la técnica de exclusión de azul de tripán. El fundamento de la técnica consiste en que las células vivas (viables), con membrana citoplasmática íntegra, excluyen el colorante vital y no se tiñen, pero en las células muertas o con lesión en membrana celular, el colorante penetra tiñendo la célula de color azul (Strober, 2015). Por lo tanto, al realizar un recuento celular, se puede expresar la viabilidad celular como el porcentaje de células que excluyen el colorante en relación con el total de células contadas.Las monocapas de BOECs cultivadas en medio suplementado con ácido fólico durante 24 h fueron lavadas con PBS estéril y tripsinizadas para su posterior tinción con azul de tripán y recuento en cámara de Neubauer. Se tomaron 20 μl de la suspensión celular y se mezclaron con igual volumen del colorante vital. Se cargó la cámara y bajo observación en microscopio invertido se contó el número células vivas/muertas presentes en los cuatro cuadrantes extremos, promediando luego el resultado. El número total de células se determinó contando cada muestra por triplicado y de tres experimentos diferentes. Finalmente, el porcentaje de viabilidad celular se calculó dividiendo el número total de células viables (sin teñir) sobre el número total de células (viables y no viables) y multiplicando el resultado por 100. Ensayo de proliferación celularEl ensayo de cristal violeta se utilizó para evaluar la proliferación de las BOECs en respuesta a diferentes concentraciones de ácido fólico. Este método mide indirectamente la cantidad de células viables que permanecen adheridas, ya que las células proliferantes retienen más cristal violeta, lo que se traduce en una mayor absorbancia (Feoktistova et al., 2016). La relación entre la absorbancia y el número de células adheridas proporciona una medida cuantitativa de la proliferación celular, permitiendo observar el efecto del ácido fólico en este proceso (Elengoe et al., 2017).Para llevar a cabo el estudio, las monocapas cultivadas en medio suplementado con ácido fólico y medio sin suplementar durante 24 h fueron lavadas con PBS estéril. Las células no adherentes se eliminaron mediante el lavado y las células restantes se fijaron con 250 µl de metanol-acético 3:1 durante 30 min. Posteriormente, se realizó un lavado adicional con PBS para retirar el exceso de fijador, se dejó secar la placa y se procedió a la tinción con cristal violeta. Para ello, se añadió 400 µl de una solución de cristal violeta al 0,5% en etanol al 2% durante 5 min. Posteriormente, se realizaron lavados con agua corriente y se dejó secar la placa a temperatura ambiente. A cada pocillo se le añadió 400 µl de etanol-acético (3:1) para eluir el colorante durante 15 min con agitación constante. La densidad óptica de cada tratamiento se midió en espectrofotómetro a 560 nm y se estableció una relación dividiendo el valor de la densidad óptica de cada tratamiento por el valor obtenido del grupo control. De esta forma, los resultados de los tratamientos se expresaron en unidades relativas en función de este valor. Ensayo de inhibiciónA fin de contrastar los ensayos de proliferación, se realizó en paralelo un ensayo de inhibición evaluando el efecto del 5-fluorouracilo (5-FU) en la proliferación celular. El 5-FU es un agente quimioterapéutico que actúa inhibiendo la enzima timidilato sintasa, bloqueando la síntesis de ADN y, por ende, la replicación celular (Longley et al., 2003). Para llevar a cabo el ensayo, los cultivos de monocapas de BOECs obtenidos en placa de 24 pocillos fueron cultivados en ausencia o presencia de 5-FU a concentraciones específicas (1, 10, 50 y 100 μM) durante 24 h a 38,5 °C, 5% CO2 y 100% de humedad. Posteriormente, se siguió el mismo protocolo de lavado, fijación y tinción con cristal violeta descripto anteriormente. El efecto inhibidor del 5-FU fue evaluado mediante la lectura de absorbancia a 560 nm. Además, se realizaron controles positivos y negativos para confirmar la especificidad del efecto del inhibidor y asegurar que las condiciones del ensayo fueran óptimas. Ensayo de cierre de heridaEl ensayo de cierre de herida permite estudiar la capacidad de migración celular, simulando in vitro un proceso de regeneración o reparación tisular. En este ensayo, se crea una "herida" en una monocapa de células mediante un raspado, y las células migran hacia el área despejada para cubrirla, siendo influenciadas por los estímulos externos (Stamm et al., 2016).Para evaluar si el ácido fólico afecta la migración de las BOECs, se sembraron 120.000 células en placas de 35 mm de diámetro y se incubaron durante 24 h a 38,5 °C, 5% CO2 y 100% de humedad hasta alcanzar monocapas confluentes en un 90%. En este punto de confluencia, se procedió a realizar una "herida" lineal en la monocapa celular utilizando un tip estéril de micropipeta de 200 µL, creando un espacio libre para evaluar la migración celular. Según el tratamiento, a las placas se les añadió medio de cultivo sin suplementar (grupo control) o bien medio suplementado con diferentes concentraciones de ácido fólico (10, 50 y 100 µM). Posteriormente se incubaron a 38,5 °C, 5% CO2 y 100% de humedad. Utilizando un microscopio invertido y cámara digital, se tomaron 3 imágenes por herida a intervalos de 6, 10 y 24 h del cultivo. El área de las heridas fue luego medida y cuantificada utilizando el software ImageJ. El porcentaje de cierre de la herida fue calculado comparando el área inicial con el área restante en los diferentes tiempos. Análisis estadísticoLos análisis estadísticos de los datos, se realizaron utilizando el software SigmaPlot 12.0 (Systat Software). La viabilidad y proliferación celular, así como el cierre de herida en respuesta a diferentes concentraciones de ácido fólico, se evaluaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía para determinar las diferencias entre los grupos experimentales. Cuando el ANOVA mostró diferencias significativas, se aplicó la prueba post-hoc de Tukey para determinar la significancia estadística. Todos los datos fueron exportados a Excel y presentados como media ± error estándar (SEM), con un nivel de significancia establecido en p < 0,05.RESULTADOS:Cultivo in vitro de BOECs en monocapaPara la obtención de los cultivos primarios en monocapa se trabajó con BOECs derivadas de oviductos bovinos en estadio preovulatorio. En este tipo de cultivo, las células se disgregan mecánicamente y al ser cultivadas se adhieren a la pared del recipiente que las contiene. A medida que crecen y se multiplican, forman una monocapa de células que llega a cubrir toda la superficie. Se sabe que para adaptarse a este sistema de cultivo las células deben atravesar un proceso de desdiferenciación en el que pierden ciertas características morfológicas como por ejemplo la polaridad (apical-basolateral) y la presencia de cilios. (Reischl et al., 1999; Abe et al., 1997).Una vez iniciado el cultivo, se realizó el seguimiento por observación en microscopio invertido y se pudo observar que las BOECs tienden a adherirse a la superficie de cultivo a las 48 h dando lugar a clones celulares aislados (Fig. 1A). A medida que pasan los días, las células proliferan y se extienden sobre la superficie de cultivo. Entre los días 6 y 7, las células confluyen en un 80-90% cubriendo casi toda la superficie de cultivo dando lugar a una monocapa de células poligonales cohesivas (Fig. 1B).Posteriormente, las monocapas de BOECs fueron tripsinizadas. Durante este proceso, la morfología celular cambia de una forma extendida y adherida a una forma más redondeada y suelta (Fig. 1C), lo que facilita la separación de las células del sustrato. Una vez tripsinizadas, se procedió al recuento de las células y se testearon diferentes concentraciones para estimar la concentración óptima de siembra para placas de 24 pocillos, que iban a ser utilizadas para los ensayos de viabilidad, proliferación e inhibición; y para placas de 35 mm, para los ensayos de cierre de herida. Considerando el tamaño del pocillo y el tiempo de incubación se seleccionó una densidad de 30.000 células por pocillo en las placas de 24 pocillos y 120.000 células en las placas de 35 mm, permitiendo alcanzar una confluencia del 80-90% tras 24 h de cultivo, optimizando así las condiciones para los ensayos posteriores.Figura 1. Cultivo en monocapa de células epiteliales del oviducto bovino. A) Clones iniciales de células epiteliales adheridas a la placa, observadas a las 48 h de cultivo. B) Monocapa confluente de células epiteliales a los 7 días de cultivo. C) Imagen representativa de las células luego de ser tripsinizadas. Se observan las células en una forma redondeada y desprendiéndose de la placa de cultivo. Barra = 50 mEvaluación de parámetros de funcionalidad celular en cultivos monocapas de BOECs estimulados con ácido fólicoa)Viabilidad CelularSe evaluó el efecto de diferentes concentraciones de ácido fólico sobre la viabilidad celular de las BOECs cultivadas en monocapa, empleando el método de exclusión con azul de tripán. Este ensayo resulta fundamental para evaluar el impacto del ácido fólico sobre la supervivencia de las BOECs.Siguiendo la metodología descripta, las monocapas de BOECs cultivadas durante 24 h en medio suplementado con diferentes concentraciones de ácido fólico (1, 10, 50 y 100 μM) o en medio sin suplementar (grupo control), fueron tripsinizadas, teñidas con el colorante vital y se procedió luego a su recuento en cámara de Neubauer bajo observación en microscopio invertido (Fig. 2A). Como se observa en la Figura 2B, las células tratadas con ácido fólico en concentraciones de 1, 10, 50 y 100 μM presentaron niveles de viabilidad comparables a las del grupo control, no observándose diferencias significativas. En todos los casos, más del 95% de las células permanecieron viables, sugiriendo que, bajo las condiciones experimentales utilizadas, el tratamiento con ácido fólico no afecta la viabilidad celular de las BOECs. Esto además refleja que las BOECs resisten ser expuestas a concentraciones elevadas de ácido fólico incluso 100 veces mayor a la concentración detectada naturalmente en el fluido oviductal que ronda alrededor de 1 μM (García et al., 2018). Por lo tanto, se concluye que el ácido fólico, en las concentraciones probadas, no afecta la viabilidad y no induce citotoxicidad en las BOECs bajo las condiciones de este ensayo.Figura 2. Ensayo de viabilidad celular mediante tinción con azul de tripán. A) Imagen representativa del conteo de células vivas/muertas en cámara de Neubauer. B) Porcentaje de viabilidad celular tras la exposición a diferentes concentraciones de ácido fólico (1, 10, 50 y 100 µM) en comparación con el control. Los datos se expresan como media ± SEM (n=3).b) Proliferación celularEl efecto del ácido fólico sobre la proliferación celular de las BOECs se evaluó mediante el método de tinción con cristal violeta. Para asegurar la precisión del ensayo, se llevó a cabo una puesta a punto inicial que incluyó la generación de una curva de linealidad del espectrofotómetro, determinando que la lectura óptima de absorbancia para el cristal violeta se encuentra a 560 nm. Esto permitió establecer un rango de lectura en el que la respuesta de absorbancia es proporcional al número de células presentes, asegurando que las lecturas no saturen el espectrofotómetro y mantengan una correlación lineal con la cantidad de células adheridas. Adicionalmente, se realizaron pruebas con diferentes densidades celulares para generar una curva de linealidad entre el número de células y la absorbancia obtenida, permitiendo optimizar el número de células sembradas por pocillo para obtener lecturas dentro del rango lineal del espectrofotómetro.Como se muestra en la Figura 3, las BOECs tratadas con ácido fólico en concentraciones de 1, 10, 50 y 100 μM mostraron una tendencia al aumento de la proliferación celular en comparación con el control. Sin embargo, no se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre los distintos tratamientos (p> 0,05). Estos resultados indican que, aunque el ácido fólico parece promover una ligera tendencia en la proliferación celular, bajo las condiciones experimentales empleadas, las diferencias no alcanzaron significancia estadística. Figura 3. Evaluación de la proliferación celular mediante tinción con cristal violeta.A) Imágenes representativas de las células tratadas con diferentes concentraciones de AF (0, 1, 10, 50 y 100 µM), teñidas con cristal violeta y observadas bajo lupa. B) Gráfico que ilustra la proliferación celular relativa en función de las diversas concentraciones de AF en comparación con el control. Los datos se expresan como media ± SEM (n=3).A fin de contrastar los resultados, se realizó un ensayo de inhibición empleando el 5-FU, un inhibidor de una enzima asociada al ciclo del folato, que ha demostrado tener un efecto directo inhibiendo la proliferación celular. Como resultado se observó un efecto dosis-dependiente. En la Figura 4 se muestran las imágenes representativas de las monocapas teñidas, donde se puede visualizar la disminución de la densidad celular respecto al aumento de la concentración de 5-FU. En base a la relación de absorbancia se observó que a medida que incrementa la concentración del inhibidor, se produce una inhibición progresiva de la proliferación celular, alcanzando hasta un 50% de reducción en comparación con el control con las concentraciones máximas de 50 y 100 g/ml de 5-FU. Esto indica que el inhibidor afecta significativamente la capacidad proliferativa de las BOECs de manera proporcional a la dosis administrada, confirmando que la inhibición del ciclo del folato es crítica y repercute negativamente en la capacidad proliferativa de las BOECs. Figura 4. Evaluación de la inhibición de la proliferación mediante tinción con cristal violeta.A) Imágenes representativas de las células tratadas con diferentes concentraciones de 5-FU (0, 1, 10, 50 y 100 µg/ml), teñidas con cristal violeta y observadas bajo lupa. B) Gráfico que ilustra la proliferación celular relativa en función de las diversas concentraciones de 5-FU en comparación con el control. Los datos se expresan como media ± SEM (n=3). ***p < 0,001 con respecto al control.c) Migración celularSe evaluó el efecto del ácido fólico sobre la migración celular de las BOECs mediante el ensayo de cierre de herida. La figura 5 muestra las imágenes obtenidas a diferentes intervalos de tiempo (6, 10 y 24 horas) y el porcentaje de cierre de herida en las monocapas de BOECs cultivadas con diferentes concentraciones de ácido fólico (10, 50 y 100 μM) o en medio sin suplementar (grupo control). En las imágenes puede observarse cómo a medida que transcurre el tiempo, las células tienden a cubrir el espacio libre, y las diferentes concentraciones de ácido fólico influyen en la velocidad de este proceso de cierre (Pakdemirli et al., 2019; Grada et al., 2017).Se observó que, a las 6 h, el cierre de la herida fue relativamente bajo en todos los grupos, sin observarse diferencias significativas entre los diferentes grupos experimentales (Fig. 5). A las 10 h, se observó un mayor cierre de la herida en todos los grupos, sin observarse diferencias significativas entre los grupos tratados. Finalmente, a las 24 h del ensayo, los grupos tratados con AF muestran una diferencia significativa en el porcentaje de cierre de la herida en comparación con el control, especialmente con las concentraciones de 50 y 100 µM (Fig 5A). Mientras que el control no alcanza un cierre completo, permaneciendo alrededor del 70%, las concentraciones crecientes de AF (50 y 100 µM) logran un cierre total de la herida (Fig. 5B). Por lo tanto, el ácido fólico ejerce un efecto positivo sobre la capacidad migratoria de las células epiteliales del oviducto bovino. Figura 5. Ensayo de cierre de herida. A) Imágenes representativas del cierre de la herida en las células tratadas con ácido fólico y control a 0, 6, 10 y 24 h. B) Porcentaje de cierre de herida a los diferentes tiempos para cada una de las concentraciones de ácido fólico ensayadas (10, 50 y 100) en comparación con el grupo control. *p < 0,05CONCLUSIONESEn este estudio, se optimizó el cultivo in vitro de BOECs en monocapa con el objetivo de investigar el efecto del ácido fólico en distintos indicadores de funcionalidad celular. La evaluación de la viabilidad celular de las BOECs en monocapa, demostró que las concentraciones probadas, no afectan negativamente la viabilidad celular de las BOECs, sugiriendo que estas células son capaces de tolerar niveles elevados de este epinutriente sin comprometer su funcionalidad básica. La proliferación celular mostró una tendencia hacia el aumento de la proliferación en las monocapas tratadas con AF, aunque no lo suficientemente pronunciado como para generar un cambio importante en la tasa de proliferación en comparación con las células del grupo control. En contraste, el tratamiento con 5-FU, mostró una inhibición dosis-dependiente de la proliferación, lo que confirma la importancia crucial del ciclo del folato. Asimismo, el ensayo de cierre de herida reveló que el tratamiento con AF influye en la capacidad migratoria de las BOECs, particularmente a concentraciones elevadas (50 y 100 μM), lo que sugiere su potencial como modulador de vías asociadas a la movilidad celular. Por lo tanto, el cultivo en monocapa de BOECs, optimizado en nuestro laboratorio, permitió determinar que el ácido fólico puede actuar como un importante modulador de la funcionalidad celular de las células oviductales. Información suministrada por el agente en SIGEVAPalabras Clave
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