Producción CyT
Investigación Veterinaria (INVET) - Efecto de la ruptura de ooquistes de Eimeria spp. en la identificación de especies mediante PCR múltiple
Congreso
Autoría:
Pisón Martínez, María Luz ; Britez, Jesica Daiana ; Rodriguez, Anabel E. ; TOMAZIC, MARIELA LUJANFecha:
2024Editorial y Lugar de Edición:
Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos AiresISSN:
1668-3498Resumen *
La coccidiosis aviar es una parasitosis intestinal causada por especies del género Eimeria,afecta a las aves de corral y es responsable de importantes pérdidas productivas y económicasen todas las escalas de producción avícola.Hasta la actualidad se encuentran identificadas siete especies distintas siendo tres de ellas lasmás frecuentes: Eimeria acervulina, Eimeria maxima y Eimeria tenella que parasitan elduodeno, yeyuno y ciegos, respectivamente. Siendo E. tenella una especie hemorrágica y unade las más patógenas. Si bien los métodos de diagnóstico tradicionales son muy utilizados yson de vital importancia no permiten diferenciar de forma certera y específica las distintasespecies.A partir de vacunas vivas comerciales con una composición de especies conocida, se buscóevaluar el efecto que posee la ruptura de ooquistes en la especificidad y sensibilidad de ladetección molecular con el fin de optimizar la técnica. Las vacunas empleadas fueron V1 conuna composición de E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. tenella y E. mitis, V2 con E.acervulina, E. maxima y E. tenella y V3 que posee las 7 especies. A las mismas se lesrealizaron un primer lavado con agua deionizada estéril y se incubaron con una solución dehipoclorito de sodio 10 minutos a 4ºC. Cada vacuna fue sometida a distintas potencias deruptura utilizando bolillas de vidrio y el disruptor celular Genie: i. “suave”: 5 ciclos de unminuto a 1.000 rpm y ii. “fuerte”: 6 ciclos de dos minutos a 2.700 rpm. Entre cada uno de losciclos se colocaron en baño de hielo dos minutos. Posteriormente, se realizó la extracción deADN utilizando el kit de extracción Wizard (Biorad) y se midió la concentración y calidaddel ADN por espectrofotometría (NanoDrop) y electroforesis en geles de agarosa. Luego, seprocedió a la identificación de las distintas especies a través de la técnica PCR múltiple donde se evidencian E. acervulina, E. tenella y E. maxima MTX 1 y E. brunetti, E.mitis, E.praecox y E. necatrix en la MTX 2.Para el caso de V1 con ruptura suave no se logra identificar ninguna especie mientras que para la ruptura fuerte, se detectan cualitativamente las cinco especies. Lo mismo ocurre con la ruptura fuerte de V2. En ambos patrones de ruptura se observó degradación del ADN pero no afectó la sensibilidad ni especificidad de la PCR-m. Para evaluar sensibilidad, se realizaron diluciones seriadas del ADN extraído de V2 tanto con la ruptura suave y fuerte. En ambos casos, a medida que el ADN se encuentra más diluido, la sensibilidad de detección de la PCR-m disminuye. Se seleccionó el método de ruptura fuerte y se evaluó la sensibilidad de la vacuna V3, que contiene las 7 especies. En conclusión, implementando ciclos de ruptura fuerte permite una mejor ruptura y mayor extracción de ADN de buena calidad, lo que resulta en un aumento de la sensibilidad en la PCR-m para detectar las distintas especies. Esto es especialmente importante en muestras con una baja cantidad de ooquistes . Con respecto a la especificidad, no encontramos variaciones entre ambos ciclos de ruptura y la detección de especies esperadas. Información suministrada por el agente en SIGEVAPalabras Clave
PCR MÚLTIPLEADNRUPTURA CELULAREIMERIA