Glicosidasas como herramientas para la diversificación estructural de moléculas bioactivas

Tesis

Resumen *

Las glicosidasas constituyen un grupo diverso de enzimas que catalizan la hidrólisis de las uniones glicosídicas, liberando así el azúcar o modificando la estructura del sustrato original. Además de la hidrólisis, algunas glicosidasas también son capaces de catalizar reacciones de transglicosilación. En este proceso, un azúcar es transferido desde un sustrato donante de azúcar a otro aceptor nucleofílico diferente del agua, formando así un nuevo enlace glicosídico. Ambas actividades tienen diversas aplicaciones biotecnológicas en constante expansión. En este trabajo estudiamos glicosidasas bacterianas y fúngicas mediante un enfoque bioquímico combinado con la exploración de genomas secuenciados por nuestro laboratorio y disponibles en bases de datos públicas (genome mining). La bacteria Actinoplanes missouriensis 431T y el hongo Aspergillus alliaceus DSM 813 fueron los microorganismos centrales del estudio. El análisis del contexto genómico del gen que codifica la diglicosidasa αRβG de A. missouriensis 431T (BAL86042.1) revelo la presencia de una α-L-ramnosidasa bajo el mismo regulador transcripcional. Este patrón genético se identificó también en cinco cepas del género Actinoplanes, lo que permitió proponer una vía catabólica para la hidrólisis de hesperidina y la utilización subsiguiente de los monosacáridos. En contraste, los estudios de producción de actividad glicosidasa en medios de cultivo con flavonoides (naringina, rutina) en A. alliaceus revelaron una vía preferencial de desglicosilación secuencial que involucra una α-ramnosidasa y β-glucosidasa. Se emplearon enzimas recombinantes y preparados enzimáticos comerciales en la síntesis de compuestos de valor agregado (hesperetin 7-O-glucósido, rutinosa, 4-nitrofenil β-rutinósido y gliceril rutinósido). El compuesto sintetizado por la α-L-ramnosidasa de A. missourensis 431T, hesperetin 7-O-glucósido, se empleó en el estudio de regioespecificidad de la diglicosidasa αRβG I de Acremonium sp. DSM 24697 permitiendo detectar por primera vez actividad monoglucosidasa de esta enzima. Cabe destacar que hesperetin 7-O-glucósido es el derivado glucosídico del sustrato de mayor especificidad de la αRβG I, hesperidina. Posteriormente, mediante ingeniería del medio de reacción se dirigió la selectividad de la mezcla de glicosidasas del cóctel enzimático comercial AromaseTM H2, permitiendo el desarrollo de procesos selectivos de producción de rutinosa y síntesis de 4-nitrofenol β-rutinósido. Finalmente, se desarrolló un bioproceso para la síntesis y purificación de gliceril rutinósido con la enzima αRβG I de Acremonium sp. DSM 24697. Se utilizaron los sustratos glicerol y el residuo del procesamiento de frutas cítricas como donante glicosídico, proponiendo una alternativa más en la biorrefinería de estas frutas. Información suministrada por el agente en SIGEVA