Expresión y ensayo de actividad de TaqPol, RT-MMLV y RTX ADN polimerasas recombinantes

Tesis

Resumen *

Muchos de los cambios revolucionarios que se han producido en las ciencias biológicas en los últimos años, pueden atribuirse directamente a la capacidad de manipular ácidos nucleicos de forma definida y precisa. Este es un atributo esencial en muchas metodologías, en las cuales se incluyen, entre otras actividades enzimáticas, las ADN polimerasas. Este grupo de enzimas se encarga de polimerizar nucleótidos utilizando otro ácido nucleico como templado, y son empleadas tanto en amplificaciones por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como en transcripción inversa (RT) seguida de PCR, RT-PCR, en sus muy diversas versiones.La producción de este tipo de enzimas es de gran interés para poder proveer localmente de una fuente segura y sustentable de dichos reactivos de biología molecular, tanto para investigación y desarrollo, como para el ámbito académico que lo requiera. Nuestra hipótesis consistió en que la producción de diferentes ADN polimerasas, inicialmente en presentaciones enriquecidas y/o purificadas, pueden obtenerse activas, y ser producidas en el futuro en la Universidad de Nacional Moreno.Con este fin, se construyeron y utilizaron plásmidos diseñados para la expresión en Escherichia coli de Taq ADN polimerasa y Transcriptasa inversa de MMLV, y, adicionalmente, se ensayó la actividad de una Xenopolimerasa RTX (exo-).Los resultados indicaron que dichos plásmidos son capaces de expresar las proteínas heterólogas. Posteriormente, se ensayó la actividad de la enzima TaqPol a partir de una fracción enriquecida y, en paralelo, se ensayó la actividad de RTX (exo-) purificada. Estas dos enzimas analizadas mantuvieron su actividad de manera adecuada, pudiendo ejecutar reacciones de PCR o RT-PCR en un solo paso, respectivamente. Asimismo, los clones productores de RT-MMLV quedaron listos para continuar con la purificación de dicha enzima. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el presente trabajo, se confirmó que se pueden obtener ADN polimerasas activas; se ejecutaron y establecieron protocolos de expresión para TaqPol y RT-MMLV; y se lograron realizar reacciones de amplificación exploratorias con TaqPol para PCR, y con la enzima RTX (exo−) para el caso de RT-PCR en un solo paso. Información suministrada por el agente en SIGEVA