Producción CyT
Congreso
Autoría
Fecha
2001
Resumen
Información suministrada por el agente en
SIGEVA
La bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA) pertenece al grupo de las P-ATPasas, enzimas capaces de transportar activamente cationes a través de la membrana celular utilizando la hidrólisis de ATP como fuente de energía. Durante su ciclo de reacción, estas enzimas dan lugar a la formación de intermediarios fosforilados estables en medio ácido (EP), cuya concentración puede ser medida luego de incubar la enzima en presencia de [g-32P]A...
La bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA) pertenece al grupo de las P-ATPasas, enzimas capaces de transportar activamente cationes a través de la membrana celular utilizando la hidrólisis de ATP como fuente de energía. Durante su ciclo de reacción, estas enzimas dan lugar a la formación de intermediarios fosforilados estables en medio ácido (EP), cuya concentración puede ser medida luego de incubar la enzima en presencia de [g-32P]ATP y posteriormente detener la reacción por desnaturalización en medio ácido. Hasta el momento, se han utilizado como métodos de aislamiento de EP la filtración y la centrifugación. Debido a dificultades metodológicas, estas técnicas permiten estudiar la dependencia de estos intermediarios con el ATP sólo en un intervalo limitado de concentraciones del nucleótido (hasta 100 mM). El aislamiento de la PMCA mediante electroforesis y posterior análisis digitalizado de las imágenes tanto del gel, como de su autorradiografía, nos permitió extender el estudio del comportamiento de EP a concentraciones fisiológicas de ATP (1,5 - 2 mM) (Echarte y col., Anal. Biochem. 289, 267-273 (2001)) Es un hecho conocido que el Mg2+ modula la actividad de la bomba de calcio, acelerando distintos pasos durante su ciclo de reacción. Por esta razón, se determinó el nivel de EP en estado estacionario en presencia de concentraciones tanto saturantes (1 mM) como limitantes (8 mM) de Mg2+. En ambos casos se observó un comportamiento bifásico de EP con la concentración de ATP, con un primer componente micaeliano cuya constante de afinidad no difiere significativamente a alta y baja [Mg2+]. El nivel máximo de EP de este componente es 2,5 veces mayor en presencia de 1 mM Mg2+. La segunda fase de la curva sigue un comportamiento sigmoideo y se observa cuando la [ATP] aumenta por encima de aproximadamente 300 mM. En este componente el nivel máximo de EP alcanzable no depende de la [Mg2+] pero la afinidad por el ATP sí es modificada por el catión. Ajustamos a los datos obtenidos una ecuación empírica que contempla el hecho de que el ATP no se une a un único sitio de la bomba sino que la regula de manera más compleja. Según el ajuste de esta ecuación el ATP estaría involucrado en 3 pasos del proceso de hidrólisis. Con el objeto de estudiar la correlación entre el nivel estacionario de los intermediarios fosforilados y la actividad global de la bomba, se midió la hidrólisis de ATP en las mismas condiciones en que fue realizada la fosforilación. Tanto en presencia de Mg2+ 1mM como 8mM, observamos un aumento hiperbólico de la actividad ATPasa con la [ATP]. La afinidad no difiere significativamente en ambas condiciones, siendo la Vmax el doble en presencia de Mg2+ 1mM. El número de recambio de EP, calculado como el cociente actividad ATPasa/EP, para las determinaciones con 1 mM Mg2+, aumenta en forma hiperbólica con una k0,5 = 15 ± 6 (mM), sugiriendo que el ATP acelera la desfosforilación de la enzima con alta afinidad. En presencia de concentraciones limitantes de Mg2+, el número de recambio de EP cae hiperbólicamente con k0,5 = 59 ± 16 (mM). El mecanismo que explica este comportamiento es tema de estudio de nuestro grupo en estos momentos. Con subsidios de CONICET, UBACYT y Subsecretaría de Salud.
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