Análisis funcional y estructural de las proteínas que componen el viroplasma del Virus del Mal de Río Cuarto. Desarrollo de estrategias biotecnológicas para el diagnóstico y control de la enfermedad

Tesis

Resumen *

El virus Mal de Río Cuarto (MRCV) es un miembro del género Fijivirus de la familia Reoviridae que causa la enfermedad viral más importante del maíz en Argentina y es transmitido de forma persistente y propagativa por chicharritas vectoras. El genoma viral consiste de 10 segmentos de ARNdc. En plantas, los síntomas de la enfermedad son enanismo, acortamiento de entrenudos, esterilidad parcial y la generación de tumores de tejido floemático en las nervaduras abaxiales de las hojas, denominados enaciones. Las plantas infectadas en estadios tardíos de desarrollo no presentan síntomas. A tiempos tempranos de la infección, las proteínas virales P6 y P9-1 y proteínas del hospedante forman viroplasmas. Los viroplasmas son macroestructuras citoplasmáticas granulares de apariencia electrodensa, que funcionan como fábricas donde ocurre la replicación genómica y el ensamblado de nuevas partículas virales. P6 y P9-1 interactúan consigo mismas y entre sí y P9-1 une ARN y presenta actividad ATPasa. Con el objetivo de profundizar en el estudio estructural y funcional de P9-1, se evaluó la influencia de los 24 residuos C-terminales (C-arm) de la proteína sobre su capacidad de multimerizar y sus actividades funcionales. El análisis de la expresión de P9-1 y de la mutante de deleción que carece del C-arm (P9-1ΔC-arm) fusionadas a GFP en células de insecto y vegetales permitió concluir que la presencia del C-arm de P9-1 es necesaria para la formación de estructuras similares a viroplasma in vivo. Por otra parte, los análisis de la interacción de las proteínas P9-1 y P9-1ΔC-arm con ácidos nucleicos indicaron que P9-1 tiene una alta afinidad por ácidos nucleicos de cadena larga mientras que P9-1ΔC-arm es más afín por ácidos nucleicos de cadena corta. Estos resultados permitieron concluir que la capacidad de unión a ácidos nucleicos está modulada por la multimerización. Asimismo, el clonado, expresión recombinante y purificación de P9-1 y de P9-1ΔC-arm realizado en esta Tesis permitió la posterior caracterización estructural de ambas proteínas por parte de grupos colaboradores quienes determinaron que P9-1 forma decámeros y dodecámeros en solución mientras que P9-1ΔC-arm forma dímeros. A continuación, se predijo la presencia de regiones intrínsecamente desordenadas (IDRs) en P9-1, identificándose dos IDRs ubicadas en la región N-terminal y en la región central. Estos resultados coincidieron parcialmente con lo observado en la estructura cristalográfica de la proteína, donde estas zonas se corresponden con loops altamente flexibles. También se predijo la ubicación del sitio ATPasa de P9-1 utilizando tres metodologías diferentes que indicaron que la región de unión a ATP se ubicaría en la interfase entre monómeros. Por otro lado, se desarrollaron herramientas para asistir al estudio del viroplasma y al diagnóstico de la enfermedad. En particular, a) se biopaneó una biblioteca de nanoanticuerpos (Nbs) obtenida a partir de la inmunización de una llama con dos mutantes de P6. A partir de un ELISA de fagos se seleccionaron tres Nbs dirigidos contra P6 y, en un análisis preliminar hecho por doble híbrido (Y2H), se determinó que los tres nanoanticuerpos se unen a la región C-terminal de la proteína; b) se caracterizó la detección de P9-1 y P9-1ΔC-arm por parte de tres Nbs seleccionados (Nb1, Nb13 y Nb25) mediante ELISA directo y western blot. Se determinó que el Nb1 se une a un epítope que no se ve afectado por la eliminación del brazo C-terminal, Nb13 podría dirigirse a un epítope presente en el brazo C-terminal o en la conformación final de la proteína completa, mientras que Nb25 reconoce a P9-1 en condiciones nativas y solo se une a la forma reducida y desnaturalizada de P9-1 ΔC-arm. Estos resultados indican que los tres Nb caracterizados son capaces de reconocer distintos epítopes y versiones de P9-1; c) se obtuvieron fusiones de los Nbs mencionados a proteínas fluorescentes que permitieron la detección de P9-1 en el floema de hojas infectadas por microscopía confocal. También se obtuvieron fusiones de estos mismos Nbs a fosfatasa alcalina (AP); d) utilizando las fusiones Nb:eGFP y Nb:AP se desarrolló un ELISA sándwich que mostró una alta sensibilidad (99,12 %, 95 % IC 95,21 ? 99,98) y especificidad (100 %, 95 % IC 96,31 ? 100) diagnósticas y un límite de detección de 0,236 ng/ml. Además, este ELISA fue útil en la detección de la presencia del virus en insectos vectores de la enfermedad. En conjunto, los resultados obtenidos contribuyen a avanzar en los mecanismos moleculares que subyacen a la formación de viroplasma y conducen a proponer la hipótesis de que la multimerización de P9-1 y la unión de dichos multímetros al ARN viral desencadena el proceso de separación de fase líquido-líquido lo que da lugar a la formación de los viroplasmas tempranos del MRCV y que este proceso depende de la presencia del C-arm. Los Nbs generados en este trabajo de Tesis asistirán al estudio de la epidemiología del MRCV, ayudarán a los programas de mejoramiento de maíz, serán herramientas valiosas para impulsar la investigación fundamental sobre la composición, estructura y la maduración del viroplasma y se utilizarán para el desarrollo de estrategias antivirales. Información suministrada por el agente en SIGEVA