Producción CyT
Congreso
Autoría
Mussio, Pablo
;
RODRÍGUEZ, MARÍA CELESTE
;
Prieto, Claudio
Fecha
2021
Editorial y Lugar de Edición
SAPROBIO
Resumen
Información suministrada por el agente en
SIGEVA
El uso de la gonadotrofina coriónica equina (eCG) se ha convertido en una terapia hormonal clave para mejorar la actividad reproductiva en diferentes tipos de ganado. Actualmente, la metodología para la obtención de PMSG (gonadotrofina sérica de yeguas preñadas), involucra un inadecuado uso de animales, lo que genera serios cuestionamientos bioéticos. Asimismo, PMSG podría contener contaminantes con potenciales riesgos sanitarios como virus o pri...
El uso de la gonadotrofina coriónica equina (eCG) se ha convertido en una terapia hormonal clave para mejorar la actividad reproductiva en diferentes tipos de ganado. Actualmente, la metodología para la obtención de PMSG (gonadotrofina sérica de yeguas preñadas), involucra un inadecuado uso de animales, lo que genera serios cuestionamientos bioéticos. Asimismo, PMSG podría contener contaminantes con potenciales riesgos sanitarios como virus o priones y presenta una gran variabilidad en su perfil de glicosilación entre distintos lotes, lo que repercute en su potencia biológica. Con el fin de resolver esta problemática, en nuestro laboratorio hemos desarrollado una tecnología basada en el cultivo de células de mamíferos para obtener un nuevo producto veterinario: la eCG recombinante (reCG). Durante su producción y almacenamiento, las proteínas recombinantes son sometidas a diferentes condiciones de estrés. En este sentido, los estudios de preformulación resultan clave en el desarrollo de un biofármaco. La caracterización del compuesto activo, permitirá desarrollar un producto seguro y eficaz que, además, mantiene su estabilidad en el tiempo.En el presente trabajo nos propusimos como objetivo diseñar estrategias de preformulación para reCG a partir del uso de diferentes técnicas analíticas.La proteína recombinante, sintetizada por células CHO K1 adaptadas a crecer en suspensión, fue purificada mediante cromatografía de pseudoafinidad a colorantes. Posteriormente, se propusieron dos principios de purificación: cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), permitiendo así obtener muestras (denominadas reCG RP-HPLC y reCG HIC, respectivamente) con un mayor grado de pureza. Como estándar se utilizaron dos marcas comerciales de PMSG, purificadas mediante RP-HPLC.El análisis densitométrico por SDS-PAGE, permitió estimar la masa molecular aparente y la pureza de las variantes. La identidad de las moléculas fue confirmada por western blot, empleando anticuerpos anti-reCG. Mediante cromatografía de exclusión molecular fue posible determinar la pureza de las muestras (reCG RP-HPLC=89%; reCG HIC=55%; PMSG RP-HPLC=73%) y estimar la masa molecular aparente de las variantes estudiadas (reCG=45 KDa; PMSG=66 KDa).Tras el análisis por RP-HPLC, se evidenció que PMSG (tr=12,95 minutos) presentó un menor tiempo de retención (tr) que reCG RP-HPLC (tr=13,58 minutos) y reCG HIC (tr=13,74 minutos), debido a diferencias en la polaridad de las moléculas.Mediante isoelectroenfoque se determinó que ambas variantes poseen un elevado número de isoformas. Sin embargo, PMSG exhibió un mayor número de isoformas concentradas en la región más ácida, debido a su mayor contenido de ácido siálico (Neu5Ac). Esto fue confirmado mediante cromatografía de intercambio iónico a pH elevado con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) (18 ± 3 y 7 ± 2 mol Neu5Ac/mol eCG, para PMSG y reCG, respectivamente; p<0,05). El análisis del perfil de N-glicanos cargados mediante cromatografía de intercambio aniónico débil evidenció un mayor contenido de glicanos neutros y tetrasialilados en las formas recombinantes. Así, en este trabajo fue posible purificar reCG para la posterior caracterización fisicoquímica en su forma nativa, mediante el uso de diferentes técnicas analíticas simples. A su vez, se realizó un estudio comparativo con PMSG, demostrando diferencias en el perfil de glicosilación de ambas moléculas.
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Palabras Clave
PROTEÍNA RECOMBINANTEPREFORMULACIÓNMEDICINA VETERINARIA