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Preparación de bibliotecas genómicas para secuenciación de ADN asociado a sitios de restricción (RAD-seq, según su sigla en inglés) para estudios poblacionales.
Metodología
Las bibliotecas de RAD se prepararán siguiendo una modificación del protocolo original descripto en Baird et al. (2008). Este procedimiento involucra cortar el ADN genómico de cada individuo con la enzima de restricción SbfI. En los extremos generados por la enzima de restricción se ligarán adaptadores (oligonucleótidos de doble cadena sintéticos), que contienen un sitio complementario a los primers para secuenciar con la plataforma Illumina y un código de 7 nucleótidos (barcode) específico par...
Las bibliotecas de RAD se prepararán siguiendo una modificación del protocolo original descripto en Baird et al. (2008). Este procedimiento involucra cortar el ADN genómico de cada individuo con la enzima de restricción SbfI. En los extremos generados por la enzima de restricción se ligarán adaptadores (oligonucleótidos de doble cadena sintéticos), que contienen un sitio complementario a los primers para secuenciar con la plataforma Illumina y un código de 7 nucleótidos (barcode) específico para cada muestra. Las muestras son posteriormente combinadas (hasta 96 muestras por biblioteca) y fragmentadas utilizando un ultrasonicador Covaris M220. Sobre el ADN sonicado se realiza una selección de tamaño de fragmentos de entre 400 y 700 pb en gel de agarosa. Posteriormente un segundo adaptador se liga a los extremos de los fragmentos y se realiza un enriquecimiento por PCR (14 ciclos). Las bibliotecas resultantes son aptas para secuenciación en dispositivos Illumina en el formato single o paired-end. Las muestras de ADN de hasta 96 individuos por cada biblioteca solicitada, conteniendo una concentración de 25 ng/ul en un volumen mínimo de 30 ul, deberán ser recibidas para su preparación en el CADIC-CONICET en Ushuaia. Las muestras las provee el solicitante del servicio; las mismas no serán de origen humano. Se entregará al comitente en tubo Eppendorf de 1,5 ml la biblioteca genómica de RAD lista para ser secuenciada en dispositivos Illumina, obtenida a partir del material entregado por el solicitante.
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