Science and Technology Production
Thesis
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Date
21/03/2018
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La fiebre aftosa es unaenfermedad viral altamente contagiosa que afecta a animales biungulados y quegenera grandes pérdidas económicas. Es producida por el virus de la fiebreaftosa (VFA), perteneciente a la familia Picornaviridae,género Aphthovirus. La partícula viral, de 22 a 30 nm de diámetro, consta de una única molécula de ARN de cadena simple ypolaridad positiva incluida dentro de una cápside icosaédrica carente deenvoltura. Di...
La fiebre aftosa es unaenfermedad viral altamente contagiosa que afecta a animales biungulados y quegenera grandes pérdidas económicas. Es producida por el virus de la fiebreaftosa (VFA), perteneciente a la familia Picornaviridae,género Aphthovirus. La partícula viral, de 22 a 30 nm de diámetro, consta de una única molécula de ARN de cadena simple ypolaridad positiva incluida dentro de una cápside icosaédrica carente deenvoltura. Dicha cápside estáconstituida por las cuatro proteínas estructurales VP4, VP2, VP3 y VP1. El genoma viral codifica además 10 proteínasno estructurales implicadas en la traducción y replicación del ARN viral. Elciclo de replicación de VFA ocurre completamente en el citoplasma de la célulainfectada. Dadas la baja fidelidad de copia y la ausencia de actividadcorrectora de errores de la ARN polimerasa viral, el VFA adopta una estructurade cuasiespecie, que se define como una población compleja de mutantesdistintas pero estrechamente relacionadas entre sí, que están sometidas a uncontinuo proceso de variación genética, competición y selección. Dada la relevancia sanitaria y económica de la fiebre aftosa, los paísesdedican grandes esfuerzos para controlar la enfermedad. La vacunación, basadaen virus inactivado químicamente, es muy efectiva pero presenta una serie dedesventajas, entre las que se encuentran la necesidad de producir grandesvolúmenes de virus activo, la incapacidad de montar una respuesta de memoria yla falta de protección cruzada entre los 7 serotipos de VFA. En consecuencia,existe una demanda global de desarrollar nuevas estrategias preventivas oterapéuticas que contribuyan a un mejor control de la enfermedad. Para ello esnecesario profundizar el conocimiento actual de los mecanismos moleculares queintervienen en la interacción entre el VFA y su hospedador y aplicarlo en eldesarrollo de nuevos agentes de control. Entre los factores de virulencia de VFA se han descrito la proteasa Lpro,la proteína no estructural 3A y las proteínas VP2, VP3 y VP1. Asimismo, se hanidentificado determinantes de virulencia en la región no traducible ubicada enel extremo 5?(5¢NT) del genomaviral. Más aún, el análisis de la estructura de la cuasiespecie representa unenfoque significativo respecto de los factores determinantes de patogenia yvirulencia. El estudio de la virulencia de VFA en el hospedador natural resultadificultoso debido a la logística y al costo asociados al manejo de grandesanimales, además de la necesidad de contar con establecimientos con estrictosniveles de bioseguridad. Para salvar esta dificultad, se han desarrolladomodelos animales que buscan imitar de alguna forma la infección natural y quepermiten estudiar algunos de sus componentes. En particular, se ha reportadoque los ratones C57BL/6J adultos resultan apropiados para detectar diferenciasde virulencia entre variantes de VFA del mismo serotipo. Estudios previos realizados ennuestro laboratorio mostraron que dos variantes de VFA serotipo A/Arg/01,denominados A01L y A01NL, presentan diferencias en su virulencia en el modeloratón adulto C57BL/6J/LAE: lainfección con A01L resulta letal para los animales, mientras que A01NL noproduce la muerte y sólo causa signos leves de enfermedad en los ratonesinoculados. Las secuencias consenso de estos virus presentan 23 diferenciasnucleotídicas sinónimas, 6 no sinónimas (2 en VP2, 2 en VP1 y 2 en la proteínano estructural 2C) y 2 mutaciones en la región 5¢NT. Asimismo,se evidenció mayor variabilidad nucleotídica en el virus A01L, como sugiere laexistencia de numerosas posiciones polimórficas a lo largo del genoma viral. En el marco de la identificación ycaracterización de factores de virulencia de VFA, en este trabajo de TesisDoctoral se propuso la hipótesis de que las alteraciones genéticas descriptasentre A01L y A01NL son responsables directas de los fenotipos diferencialesobservados en el modelo ratón adulto. En primer lugar, se profundizó el estudio de la patogenia de A01L yA01NL en el modelo ratón adulto mediante el análisis histopatológico demuestras de órganos obtenidos a distintos tiempos postinoculación y ladeterminación de la cinética de replicación viral en los animales inoculados.Ambos virus produjeron un cuadro de pancreatitis aguda con necrosis del tejidopancreático. Los resultados obtenidos permiten destacar la mayor capacidadreplicativa de A01L por sobre A01NL en el contexto de un sistema inmune activo.Además, se demostró que la infección con A01NL induce anticuerposneutralizantes que protegen a ratones adultos frente a una infección letal conA01L. Para evaluar si las diferencias en la patogenicidad exhibida por A01L yA01NL en el modelo ratón adulto podían ser reproducidas en cultivos celulares,se realizaron curvas de crecimiento de múltiples pasos en células susceptiblesa VFA. No se observaron diferencias entre los perfiles replicativos de ambasvariantes en las líneas celulares IBRS-2, PK15, MDBK y BHK-21, así como en uncultivo de células de riñón fetal bovino (RFB). Por el contrario, el virus A01Lalcanzó títulos significativamente más altos que A01NL en células de riñónovino (Rov). Estos resultados sugieren que los virus A01L y A01NL estableceninteracciones específicas y diferenciales con los distintos hospedadoresestudiados, que le otorgan una ventaja replicativa a A01L tanto en células Rovcomo en el modelo ratón adulto. A fin de estudiar e identificarlos determinantes de la patogenia y virulencia diferencial de A01L y A01NL, se construyeronmediante genética reversa los virus mutantes 2211Lc, 2515Lc, 3688Lc, 3775Lc yCapLc (2211-2515-3688-3775L), que incluyen las 4 sustituciones no sinónimaspresentes en la cápside de A01L en el contexto genómico de A01NL. Asimismo, seobtuvo el virus quimérico A01Lc (2211-2515-3688-3775L-2C-3A), que incluyeademás la región codificante para 2C-3A del virus A01L en el contexto genómicode A01NL. Se evaluaron las características fenotípicas de los virus obtenidos encélulas Rov (título a las 24 hpi), comparándolas con las del virus A01NLc, un cloninfeccioso derivado de A01NL. De este modo, se determinó que el virus A01Lcpresenta la misma capacidad replicativa que A01L. Además, se realizó la caracterizaciónfenotípica de los virus mutantes y quiméricos en el modelo ratón adulto. Eneste caso, se determinó que el virus CapLc produce signos moderados o severosde enfermedad, mientras que el virus A01Lc reproduce el fenotipo letal de A01L. Por otro lado, se realizó lasecuenciación de alto rendimiento de los virus parentales A01L y A01NL, asícomo de los virus derivados de los clones moleculares A01Lc y CapLc, a fin deevaluar la complejidad de la cuasiespecie viral y estimar su impacto sobre lavirulencia. Se analizaron los sitios polimórficos mediante el programa Lofreq,que evidenció tres niveles de variabilidad poblacional: el virus A01L presentóla mayor variabilidad, comprendida como el mayor número de polimorfismos dealta frecuencia a lo largo de su genoma, el virus A01NL presentó un menornúmero de posiciones polimórficas y de menor frecuencia, y por último los virusderivados de clones moleculares (A01Lc y CapLc) mostraron una variabilidadmínima. Además, se utilizó el programa Qure para reconstruir in silico la cuasiespecie de cada virus,con el fin de evaluar la relación entre los sitios polimórficos y estimar lacomplejidad viral. Los resultados obtenidos denotan que el virus A01L es máscomplejo que el virus A01NL, en tanto los virus A01Lc y CapLc mantienen sunaturaleza clonal en las muestras en estudio, obtenidas luego de 4 pasajes encélulas BHK-21. Los resultados obtenidos enesta Tesis Doctoral demuestran que losresiduos aminoacídicos de VP2 y VP1 presentes en A01L son suficientes paraproducir signos severos de enfermedad y letalidad en ratones adultos, en tantola secuencia de las regiones 2C y 3A de A01L contiene determinantes genéticosque contribuyen a la virulencia de este virus en ratones adultos sin determinarla letalidad. Más aún, la complejidad de la cuasiespecie viral no constituye undeterminante del fenotipo diferencial observado entre ambos virus. El análisisdetallado de los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo delfenotipo diferencial constituirá un aporte invaluable para profundizar elconocimiento de los determinantes de virulencia de VFA en hospedadoresnaturales.
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Key Words
DETERMINANTESAFTOSACLONESLETALIDADVIRULENCIA