Science and Technology Production
Thesis
Authorship
Date
01/01/2012
Summary
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SIGEVA
RESUMEN Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la pérdida progresiva e irreversible de neuronas, lo cual perjudica seriamente las funciones neurológicas, por lo que es indispensable encontrar una solución efectiva a esta problemática. El sistema nervioso es de difícil acceso y de una enorme complejidad. Utilizar modelos que permitan analizar la génesis y la muerte neuronal, resulta clave para comprender la evolución y esta...
RESUMEN Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la pérdida progresiva e irreversible de neuronas, lo cual perjudica seriamente las funciones neurológicas, por lo que es indispensable encontrar una solución efectiva a esta problemática. El sistema nervioso es de difícil acceso y de una enorme complejidad. Utilizar modelos que permitan analizar la génesis y la muerte neuronal, resulta clave para comprender la evolución y establecer potenciales tratamientos para las enfermedades neurodegenerativas. La retina es un excelente sistema para indagar en estos procesos, dado que forma parte del sistema nervioso central y presenta una estructura laminar sencilla. En la retina, las enfermedades neurodegenerativas que afectan a las neuronas fotorreceptoras - como la Retinitis Pigmentaria o la Degeneración Macular - culminan con la ceguera de los pacientes afectados. Actualmente se presentan dos posibles estrategias de tratamiento para estas enfermedades: la primera busca conocer los mecanismos que conducen a la apoptosis neuronal, de manera de evitarla mediante el uso de factores que promuevan la supervivencia de los fotorreceptores. La segunda propone regenerar las neuronas perdidas durante la enfermedad mediante el uso de stem cells o células madre, las cuales se caracterizan por la auto-renovación y multipotencialidad. Las células gliales de Müller (CGM) serían stem cells en la retina. Numerosos trabajos indican que las CGM son capaces de de-diferenciarse y proliferar luego de un daño en la retina, para luego expresar marcadores de fotorreceptores. Este comportamiento es ampliamente reconocido en peces y anfibios, sin embargo resulta más restringido en aves y mamíferos. Para poder utilizarlas en el tratamiento de patologías degenerativas, es clave conocer varios aspectos de la biología de las CGM como stem cells en animales superiores. Por otra parte, la rápida muerte por apoptosis de las células regeneradas dificulta notablemente el éxito de las terapias de reemplazo. Por lo tanto, es importante dilucidar cómo evitar dicha muerte. Estudios previos de nuestro laboratorio indicaron que las CGM expresaron marcadores de multipotencialidad por largos períodos in vitro, y que esta expresión era regulada por la interacción con neuronas de retina o el agregado de factores tróficos. El objetivo del presente trabajo de Tesis fue evaluar el potencial comportamiento como células madre de las CGM de roedores, determinando si eran capaces de generar neuronas fotorreceptoras in vitro. Para ello diseñamos tres sistemas de cultivos celulares de retina (neuronales puros, gliales puros y cultivos mixtos neuro-gliales) en los cuales analizamos la presencia, origen y evolución de progenitores multipotentes, determinando si retenían las características de multipotencialidad a través de los pasajes. A continuación evaluamos la capacidad de diferenciación de dichos progenitores en FRs maduros y funcionales; y si el agregado de factores lipídicos podía prevenir la apoptosis de los FRs regenerados. En el Primer Capítulo evaluamos si las CGM presentaban dos características de las células madre: la capacidad de expresar marcadores de multipotencialidad a través de los pasajes, y de generar progenitores neuronales. Determinamos que tras el repique de cultivos enriquecidos en CGM, las CGM retuvieron la expresión de Nestina, a la vez que co-existieron con una población de progenitores que bajo condiciones adecuadas se diferenciaron en neuronas. La existencia de progenitores en estos cultivos secundarios planteó cuatro preguntas: ¿De dónde provienen los progenitores? ¿Expresan otros marcadores de multipotencialidad? ¿Es posible diferenciarlos en FRs? ¿Existen factores que promuevan su supervivencia y/o diferenciación? Antes de avanzar con ellas evaluamos si las dos poblaciones mayoritarias en cultivos primarios de retina (CGM y neuronas), influían en el destino que los progenitores adoptaban in vitro. Determinamos que sólo la interacción de CGM con neuronas de retina permitía la generación y/o conservación de progenitores multipotentes por largos períodos en cultivo. En el Segundo Capítulo analizamos el origen y la expresión de marcadores de multipotencialidad en los progenitores observados tras el repique. Determinamos que los progenitores expresaron -además de Nestina- Sox-2 y Pax-6 a la vez que conservaron su capacidad proliferativa. Estas características se observaron sólo en los pasajes de cultivos mixtos neuro-gliales: los cultivos puros neuronales no sobrevivieron al repique, mientras que los cultivos puros de CGM no generaron progenitores de retina. Los progenitores retuvieron la expresión de Pax-6 y Sox-2 y continuaron proliferando aún luego de cuatro pasajes sucesivos de cultivos mixtos. Algunos de ellos, inclusive, expresaron Crx, hecho que indicaba su capacidad de diferenciación en neuronas fotorreceptoras. Para establecer el origen de los progenitores de retina en los repiques, utilizamos una sonda fluorescente que nos permitió identificar la progenie tanto de los progenitores como de las CGM. Este análisis sugirió que los progenitores multipotentes observados en los sucesivos repiques se originarían en progenitores pre-existentes preservados por la interacción con las CGM y no en las CGM. En el tercer capítulo investigamos la capacidad de diferenciación de los progenitores multipotentes en neuronas fotorreceptoras. Determinamos que en los cultivos mixtos neuro-gliales, bajo condiciones adecuadas de cultivo los progenitores se diferenciaron en FRs maduros y funcionales, que expresaron marcadores característicos de FRs (como Crx, Opsina, Periferina) a la vez que fueron capaces de responder a la luz y de capturar glutamato por mecanismos de alta afinidad. Por último, investigamos si era posible bloquear o retrasar el desarrollo de la apoptosis en las células regeneradas. Determinamos que la administración de DHA y S1P - dos moléculas lipídicas con efectos anti-apoptóticos en fotorreceptores-disminuyeron significativamente la apoptosis neuronal en los repiques. En conclusión, en este trabajo de Tesis establecimos una nueva función para las células gliales de Müller: su capacidad de transformar a las células progenitoras de retina en células multipotentes, y de promover su diferenciación en neuronas fotorreceptoras. Esta novedosa función podría ser relevante al momento de diseñar nuevas estrategias para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de la retina.
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Key Words
PROLIFERACIONCELULAS MADRECELULAS GLIALESNEURODEGENERACION