Mecanismos inmunológicos involucrados en la prevención del rechazo semi-alogénico fetal

Thesis

Summary *

La tolerancia del feto como semi-injerto por parte del sistema inmune materno es una consecuencia de una gran variedad de mecanismos interconectados. En el presente trabajo se investigaron distintos mecanismos inmunológicos involucrados en la generación y mantenimiento de la tolerancia materno-fetal. Asimismo, se estudiaron posibles fallas en estos mecanismos que podrían provocar abortos recurrentes espontáneos (ARE), así como también se buscaron marcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico de esta patología. Una de las hipótesis actuales para explicar la sobrevida fetal, sugiere que factores bloqueantes (FB) del cultivo mixto linfocitario (CML) tendrían un papel relevante el la inducción de la tolerancia materno-fetal y potencialmente podrían utilizarse para prevenir abortos recurrentes. A este respecto observamos que tanto los Acs. leucocitotóxicos (evidenciados a través de la técnica de cross-match por citometría de flujo) y los inhibidores de la respuesta alogénica (evidenciados in vitro en el CML), son mas frecuentes en el suero de mujeres fértiles que en las mujeres con ARE. Sin embargo el hecho que estén presentes en el 26% de las mujeres con ARE, y estén ausentes en el 10% de las mujeres con embarazos exitosos, respectivamente, sugieren que ambos parámetros representan una respuesta al embarazo mas que la causa del mismo. Esta primer evidencia nos llevó a investigar y caracterizar FB utilizando como modelo in vitro el CML. De este modo se evidenció que Galectina-1, una glicoproteína de unión a -galactósidos que se expresa en sitios inmunológicamente privilegiados, induce una inhibición de la respuesta alogénica en forma dependiente de la dosis y de la unión a carbohidratos. Este efecto negativo resultó en un aumento significativo de los niveles de apoptosis de células CD45R0+, acompañado por una activación de caspasas, disminución de la expresión de Bcl-2 y pudo prevenirse por el agregado de IL-2 exógena. Además, luego de la exposición de linfocitos aloreactivos a Gal-1, se observó una disminución significativa de la producción de IFN- en células no apoptóticas. Mas aún, se detectó Gal-1 endógena a las 24 hs de cultivo, alcanzando su máxima expresión a las 72 hs de aloestimulación, sugiriendo una función inmunosupresora durante la fase efectora de la respuesta alogénica. Seguidamente se investigó la propiedad inmunomodulatoria de las -quimioquinas en la respuesta alogénica materna. Encontramos una disminución significativa en los niveles séricos de RANTES en pacientes con ARE en comparación con los detectados en mujeres fértiles, por lo cual se investigó su papel como FB del CML. RANTES fue capaz de inhibir el CML en forma dependiente del tiempo y de la dosis, a través de la modulación de los niveles proteicos de Bcl-2 y mecanismos independientes de caspasas. Por su parte, los niveles disminuidos de RANTES en el suero de mujeres con ARE con respecto a mujeres fértiles, y su significativa correlación con los FB del CML apoyan la idea de que RANTES podría actuar como un FB activo en la respuesta alogénica materna. Más aún, sueros conteniendo FB del CML son capaces de inducir mayores porcentajes de apoptosis comparados con los obtenidos con sueros sin actividad bloqueante; así como también el Ac. específico anti-RANTES es capaz de revertir la inhibición de la proliferación y los niveles de apoptosis inducida por sueros con FB del CML. Estas evidencias avalan el rol de RANTES como un FB del CML activo en el contexto de la respuesta alogénica. Sin embargo, como se mencionó previamente, la ausencia de FB del CML en una minoría de mujeres fértiles, nos llevó a la búsqueda de nuevos marcadores para el diagnóstico de ARE, por ello estudiamos marcadores de activación como CD69 y SLAM (del inglés: signaling lymphocytic activation molecule). Así, se identificamos la población CD3+CD69intracitoplasmático en sangre periférica y en endometrio de pacientes con ARE con características fenotípicas y funcionales particulares. Esta subpoblación de linfocitos T CD3+CD69+ esta distribuida homogéneamente entre ambas subpoblaciones de memoria, central y efectora, y representada tanto por linfocitos CD4+ como por CD8+. Su capacidad proliferativa hiporeactiva frente a diversos estímulos y su selectiva producción de IL-10 frente a estímulos alogénicos, sugieren una función regulatoria. Del mismo modo, SLAM (una glicoproteína de superficie expresada en linfocitos T) estaba aumentada significativamente y específicamente en linfocitos T y en células endometriales de mujeres con ARE con respecto a mujeres fértiles. Por otra parte y continuando con el estudio de citoquinas, se investigó la expresión de citoquinas Th1 y Th2 en endometrio de mujeres con ARE y fértiles en condiciones pre-implantatorias. Encontramos solamente una tendencia aumentada a la producción de IL-10 en el endometrio de mujeres fértiles. En cambio, cuando se analizaron los niveles de IFN producidos por linfocitos endometriales y de sangre periférica luego de activación policlonal, se encontró un aumento significativo en la producción de IFN- en mujeres fértiles en comparación con pacientes con ARE. La producción aumentada de INF por los linfocitos T endometriales y de sangre periférica de mujeres fértiles a estímulos policlonales, podría relacionarse con su capacidad para favorecer la neovascularización necesaria durante el proceso de decidualización. El estudio de las presentes poblaciones celulares y de sus posibles funciones regulatorias /supresoras continúa abierto, implicando cada una de ellas grandes ramas de investigación. En el presente trabajo, no solamente se investigaron diversos mecanismos inmunológicos involucrados en el rechazo fetal, sin que también se buscó ofrecerles a las pacientes con ARE un tratamiento efectivo para su patología. Así, se investigó la efectividad de la inmunoterapia con leucocitos paternos utilizando diversos grupos controles y rigor estadístico correspondientes a un estudio poblacional. Este análisis reveló que la tasa de éxito luego de la inmunoterapia con leucocitos paternos es de 89%. Si bien este valor no es diferente significativamente al encontrado en el grupo control de pacientes con ARE no inmunizadas, la diferencia absoluta entre ambos grupos es 18%. Además, la tasa de éxito en pacientes con 2 abortos previos es superior a la encontrada en pacientes con 3 o más abortos, sin embargo, estas pacientes también pueden favorecerse con la aloinmunización paterna. Cuando se correlacionó el éxito de un nuevo embarazo con la generación de FB del CML, tanto las mujeres que lograron un embarazo exitoso o las que sufrieron un nuevo aborto, luego de la aloinmunización, fueron capaces de generar FB del CML sugiriendo que podrían representar un epifenómeno. De lo cual se desprende la búsqueda de nuevos marcadores para el seguimiento de pacientes con ARE bajo tratamiento. De este modo se evidenció que la aloinmunización en pacientes con ARE induce un aumento sistémico de RANTES, revierte los altos porcentajes de células CD3+CD69+ en mujeres con ARE alcanzando los niveles observados en las mujeres fértiles y tienden a disminuir los porcentajes de linfocitos T SLAM+ llevándolos a los niveles observados en las mujeres fértiles. Estos resultados, al igual que el aumento de la respuesta alogénica materna en el 72% de las mujeres con ARE que tuvieron éxito luego del tratamiento, reflejan una inmunomodulación de clones T y/o factores solubles responsables de cambios sistémicos y en la interfase materno-fetal compatibles con un embarazo exitoso. Por último, si bien estos parámetros prometen ser reveladores actuando como marcadores útiles para el seguimiento de pacientes con ARE, la identificación de poblaciones regulatorias/supresoras actuando vía interacción célula-célula o a través de la producción de factores solubles continúa abierta, lo cual motiva la presente solicitud de beca post-doctoral. Information provided by the agent in SIGEVA