Compuestos naturales y sintéticos que modulen la actividad biológica de los interferones de tipo I: análisis mediante una nueva herramienta biológica

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Los interferones (IFNs) constituyen una familia de glicoproteínas especie-específica que cumplen un rol muy importante en la primera barrera de defensa del organismo contra las infecciones virales. Estas proteínas son producidas por cada individuo para actuar en forma local y tienen actividad antiviral, antiproliferativa, antitumoral e inmunomoduladora. Son ampliamente utilizados como biofármacos para el tratamiento de diversas patologías, administrándolos de forma exógena. Es por esto que su potencia debe ser correctamente valorada. Habitualmente, la actividad biológica de dichas moléculas se cuantifica mediante un bioensayo, basado en la capacidad de los IFNs para inducir un estado antiviral en las células target, frente a la infección viral con el virus de la estomatitis vesicular (VSV). Sin embargo, este tipo de ensayos presentan grandes variaciones intra- e inter-ensayos y requieren del empleo y manipulación de virus.En el presente trabajo de tesis se generó un ensayo de gen reportero (EGR) basado en líneas celulares reporteras Mx2/EGFP para determinar la actividad de los hIFNs I. Cuatro líneas celulares provenientes de diferentes linajes celulares (WISH, A549, HeLa y HEp-2) fueron transfectadas en forma estable con el plásmido pMx2/EGFP. Este vector contiene el gen de la proteína reportera de fluorescencia verde (GFP) bajo el control del promotor Mx2, inducible específicamente por IFNs-I. De esta forma, cuando el IFN se une a sus receptores en la superficie celular, se desencadena una cascada de señalización/activación que concluye con la activación del promotor Mx2 en el núcleo. Como resultado, se expresa la EGFP que es cuantificada mediante citometría de flujo. De esta forma, el porcentaje de células verdes positivas se correlaciona directamente con la cantidad de IFN presente en la muestra.Este ensayo presenta la ventaja de emplear líneas celulares frecuentemente utilizadas para determinar la potencia de los hIFNs, tal es el caso de la línea WISH, simultáneamente con el uso de un gen reportero muy sensible, el EGFP. Además, cuenta con numerosas ventajas comparado con el ensayo de actividad antiviral y otros ensayos de genes reporteros, ya que es capaz de determinar la potencia de hIFN-α y hIFN-β usando una única línea celular, obteniendo la máxima expresión de EGFP a las 24 h. Debido a la especificidad del promotor Mx2, sólo se observa expresión de la proteína reportera sobre aquellas células tratadas con hIFNs-I. Es un ensayo sensible y representa una alternativa segura al ser comparado con los ensayos antivirales convencionales. Presenta coeficientes de variación (CV) intra- e inter-ensayos inferiores al 20%, demostrando su buena reproducibilidad. En conclusión, se ha logrado desarrollar un ensayo reportero alternativo para el análisis de los hIFNs-I, cuya performance lo convierte en un candidato adecuado para reemplazar o complementar los bioensayos habituales.Si bien los hIFNs-I son ampliamente utilizados como biofármacos, éstos son rápidamente depurados del organismo, lo que implica el uso de elevadas y reiteradas dosis. Asimismo, se han registrado efectos secundarios adversos en algunos tratamientos, que en muchos casos conducen a la interrupción de los mismos. Por otra parte, se ha indicado la existencia de patologías en las cuales se observa una liberación excesiva de IFN endógeno, generando efectos nocivos para el organismo.Como consecuencia, el IFN se presenta como una molécula central cuyo accionar debe regularse para evitar los inconvenientes clínicos mencionados. En este sentido, es indispensable incrementar su eficacia terapéutica en aquel grupo de patologías que requieran de su administración exógena y, por otro lado, bloquear sus efectos nocivos en aquel conjunto de enfermedades en las que la producción de IFN endógeno constituye parte de la etiología o curso de las mismas. En consecuencia, se ha propuesto la identificación y caracterización de nuevas moléculas, que actúen en forma sinérgica o antagónica con la actividad de los IFNs-I.El monitoreo del efecto de diferentes compuestos sobre la actividad biológica de los IFNs requiere de métodos versátiles, sencillos, robustos y que contribuyan con una elevada velocidad de procesamiento. Por lo tanto, contar con un ensayo biológico basado en una línea celular que responda a hIFNs-I y que exhiba tales características es trascendental para el cumplimiento del objetivo propuesto.Con ese fin, en una segunda etapa de este trabajo de tesis, se emplearon las líneas celulares reporteras para monitorear 552 compuestos provenientes de bibliotecas de compuestos naturales y sintéticos, en presencia de rhIFN-α2a o rhIFN β1a mediante el ensayo de gen reportero desarrollado. Utilizando este sistema pudieron identificarse 20 compuestos sintéticos inhibidores de la actividad de los hIFNs-I y 5 compuestos naturales, 4 de ellos inhibidores y 1 potenciador de los hIFNs I. Todos ellos fueron estudiados con el fin de validar el nuevo ensayo. En conclusión, en este trabajo de tesis se logró desarrollar 4 líneas celulares reporteras capaces de cuantificar la actividad de los hIFNs-I, que fueron posteriormente utilizadas como herramientas biológicas para monitorear bibliotecas de compuestos sintéticos y naturales como posibles moduladores de la actividad de los hIFN-I. Information provided by the agent in SIGEVA