Asociación argentina de microbiología - Construccion de un nuevo transposon mini-Tn5 portador de un origen de replicación bacteriano para su uso en estudios RIVET en rizobios

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Introducción: Los rizobios son bacterias gram-negativas que habitan el suelo y se caracterizan por fijar nitrógeno atmosférico cuando se asocian en simbiosis con plantas leguminosas. Dicha asociación es el resultado de un conjunto de eventos de señalización cuyos genes asociados no han sido aun del todo caracterizados. La técnica RIVET (Recombination based In Vivo Expression Technology) permite identificar genes que, en una condición particular, se expresan de modo diferencial respecto de una condición fisiológica de referencia. En nuestro laboratorio se ha desarrollado una variante de la técnica RIVET que usa un transposón derivado del Tn5 como herramienta para generar fusiones transcripcionales a lo largo del genoma al gen de una resolvasa (tnpR) localizada en un extremo del transposón. La expresión de TnpR en clones específicos resultará en la escisión de un cassette de DNA que cambiará el fenotipo de la bacteria indicando que el gen fusionado a la resolvasa en dicho clon se ha expresado. Objetivos: Construcción de un nuevo MiniTn5 portador de un origen de replicación (oriV) bacteriano funcional en E. coli que facilite la recuperación de secuencias flanqueantes al transposón en clones que resulten de interés luego de la aplicación de la técnica RIVET. Materiales y Métodos: Medios de cultivo complejos TY, LB. Conjugaciones bacterianas siguiendo protocolos clásicos. Técnicas moleculares según Maniatis et al. (1982). Resultados: Se clonó un origen de replicación funcional en E. coli proveniente del plásmido pSM10 dentro del sitio NotI presente en un transposón mini-Tn5, haciendo uso de oligonucleótidos como adaptadores, dando como resultado el plásmido llamado pRIVET-miniTn5-ori. Teniendo en cuenta que el vector pRIVET-miniTn5 no posee capacidad de replicarse en cepas de E. coli que no poseen la proteína “pi”, la recuperación de clones que poseen el oriV clonado dentro del sitio NotI del vector se realizó mediante la selección de aquellos clones que poseían la capacidad de crecer en un medio selectivo conteniendo tetraciclina, resistencia codificada por el vector. Los clones obtenidos fueron verificados por su fenotipo, su patrón de restricción y su secuencia. Para la nueva herramienta RIVET analizamos la capacidad de transposición en Sinorhizobium meliloti y la funcionalidad de la resolvasa codificada por el transposón. Conclusiones: Hemos construido un nuevo transposón portador de un oriV funcional en E. coli. Hemos verificado que la nueva construcción mantiene la capacidad de transponer en S. meliloti y que, como es esperable, en muchas de sus inserciones da lugar a escisiones del cassette de DNA blanco de TnpR. El sistema presentado es el primero en su tipo, y constituye una herramienta práctica muy eficiente para generar fusiones génicas a tnpR para estudios RIVET evitando la construcción de bibliotecas genómicas de fusión en vectores plasmídicos. Information provided by the agent in SIGEVA