ESTUDIO DE LA PROTEÓLISIS EN LAS ARQUEAS: CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LA PROTEASA ATP-DEPENDIENTE LON EN LAS ARQUEAS HALÓFILAS EXTREMAS

Thesis

Summary *

Las arqueas representan uno de los tres dominios de la vida: Eukarya, Bacteria y Archaea. Si bien las arqueas comparten aspectos estructurales y/o fisiológicos con las bacterias y eucariotas, también poseen propiedades únicas (ej. membranas). Muchos de sus representantes habitan en ambientes extremos por lo cual han desarrollado adaptaciones bioquímicas y fisiológicas particulares. Este es el caso de las arqueas halófilas, las cuales predominan en ambientes hipersalinos (> 2 M NaCl). Dado su carácter extremófilo, las arqueas son un buen modelo para estudiar las adaptaciones de los procesos celulares y moléculas en condiciones ?no convencionales?. El avance del conocimiento de la biología de las arqueas permitirá aplicar a estos microorganismos y/o a sus biomoléculas en diversos campos (ej. biotecnología).La proteólisis es una estrategia clave para el control de las funciones celulares y se encuentra mayormente regulada por proteasas dependientes de energía. Estas enzimas presentan una estructura oligomérica organizada en dos compartimentos: el dominio ATPasa, responsable de la unión y desplegado de los sustratos, y el dominio proteolítico donde ocurre la degradación procesiva del sustrato. Estos complejos proteolíticos incluyen: el proteasoma (HslUV), Lon, FtsH y Clp. Las proteasas ATP-dependientes no solo son fundamentales para el control de calidad de las proteínas, degradando aquellas defectuosas y/o mal plegadas, sino también para la regulación de numerosos procesos celulares.La proteasa Lon se encuentra altamente conservada en los tres dominios de la vida y, dependiendo de su estructura, se las clasifica en dos subfamilias: LonA y LonB. La subfamilia LonA está constituida por enzimas solubles que están presentes en bacterias y organelas de organismos eucariotas. La subfamilia LonB predomina en las arqueas y, a diferencia de LonA, poseen un dominio hidrofóbico en la región ATPasa que ubica a esta enzima sobre la cara citoplasmática de la membrana arqueana. La proteasa LonA no es esencial para la supervivencia en la mayoría de las bacterias en condiciones normales, sin embargo, algunas cepas bacterianas mutantes en el gen lon muestran defectos severos. Cepas Δlon de Escherichia coli (y otras enterobacterias) acumulan proteínas anormales ya que Lon es la principal proteasa involucrada en la degradación de proteínas mal plegadas; forman colonias mucoides y largos filamentos luego de ser expuestas a la luz UV. Asimismo, estas mutantes no son capaces de adaptarse a condiciones ambientales adversas. En organismos eucariotas, LonA degrada proteínas modificadas por oxidación en la matriz mitocondrial y se la ha asociado al desarrollo de diversas enfermedades humanas como el cáncer, el mal de Parkinson y Alzheimer.Mientras que las proteasas Lon de origen bacteriano y de organelas han sido caracterizadas exhaustivamente, la biología de la proteasa Lon en el contexto de las células arqueanas se conoce escasamente. Teniendo en cuenta su diferente localización subcelular, esta enzima podría cumplir funciones y/o degradar sustratos novedosos.En este trabajo se investigó el rol biológico de la proteasa de membrana LonB en las arqueas. Con este fin, se analizó la expresión de LonB (ARN mensajero y proteína) en la haloarquea modelo Haloferax volcanii en distintas condiciones de crecimiento. Por otra parte, se construyeron cepas mutantes de H. volcanii deficientes en el contenido de esta enzima y se analizó su fenotipo. Se observó que la proteasa Lon es esencial para el crecimiento de H. volcanii y niveles subóptimos de la misma afectaron el crecimiento y la forma celular, la pigmentación, la composición lipídica y la sensibilidad a diversos antibióticos. El análisis proteómico de una cepa de H. volcanii deficiente en Lon mostró que esta proteasa tiene un impacto global sobre la fisiología de este organismo afectando el nivel de proteínas involucradas en diversos procesos metabólicos y genéticos, así como también proteínas de función desconocida. En este contexto, varias proteínas resultaron sensiblemente estabilizadas por la mutación de lon revelando potenciales sustratos naturales de esta proteasa. Una de las proteínas más notables es la fitoeno sintasa, enzima clave de la ruta biosintética de carotenoides. Information provided by the agent in SIGEVA