Science and Technology Production
XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología - Caracterización molecular del gen ac12 del baculovirus Autographa californica Mutiple Nuclear polyhedrosis virus
Congress
Authorship:
Costa Navarro Guadalupe Soledad ; Lopez María Gabriela ; Taboga Oscar ; ALFONSO, VICTORIADate:
2016Publishing House and Editing Place:
AsociacIón Argentina de MicrobiologíaSummary *
Los baculovirus son virus patógenos de insectos, con aplicaciones biotecnológicas, pertenecientes a la familia . Poseen genoma ADN doble cadena circular empaquetado en un virión envuelto con forma de bastón. Se caracterizan por desarrollar un ciclo de replicación bifásico con dos fenotipos diferenciados: virus brotados y virus derivados de cuerpos de oclusión, siendo el último el fenotipo presente en las estructuras de resistencia viral, los poliedros. El genoma de la especie mejor caracterizada de la familia, multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), es de 133 kpb y contiene aproximadamente 150 ORFs predichos de los cuales existe un gran número con función aún desconocida. El ORF12 de AcMNPV es un gen que se encuentra en sólo otros tres nucleopoliedrovirus, cuya secuencia codificaría para una proteína de 217 aminoácidos (Ac12), de existencia aún no demostrada, que contiene un dominio predicho potencialmente involucrado en caminos de ubiquitinación de proteínas. Dada la importancia del estudio de la función de las proteínas baculovirales para conocer su participación en el ciclo de replicación, el objetivo de esta investigación fue determinar el papel del ORF12 en la infección de AcMNPV tanto en cultivo celular como en larvas de insecto. Para ello se generó un virus mutante por deleción del gen mediante recombinación entre un producto de PCR con un de resistencia a cloranfenicol flanqueado por secuencias del gen y el bácmido bMON14272 () que contiene el genoma completo de AcMNPV. El ADN del bácmido recombinante fue transfectado en células de insecto, se evaluó su capacidad de diseminar la infección y no se detectaron diferencias comparado con un virus control. Además, a fin de evaluar las cinéticas de multiplicación para ambos virus, se realizaron curvas de crecimiento de un paso que tampoco mostraron diferencias. También se estudiaron las células infectadas por microscopía electrónica de transmisión y los poliedros producidos por el virus mutante, mediante microscopía electrónica de barrido. Así, se determinó que los poliedros tenían un diámetro menor que los salvajes (p<0,01); sin embargo, las curvas de mortalidad de larvas de infectadas por vía oral fueron similares para ambos virus. Paralelamente, se caracterizó el ORF12 en cuanto a su cinética de transcripción por RT-PCR. El transcripto se detectó a partir de las 30 horas postinfección y mostró heterogeneidad en su extremo 5´, en ensayos de 5´RACE. También se generó un baculovirus recombinante con un V5 en una segunda copia del ORF12 dirigida por su propio promotor, lo que posibilitó la inmunodetección de la proteína Ac12 en lisados de células infectadas. En base a todos estos resultados, se concluye que de AcMNPV es un gen tardío codificante, que da lugar a una proteína no esencial, potencialmente involucrada en la correcta morfogénesis de los cuerpos de oclusión. Information provided by the agent in SIGEVAKey Words
KNOCKOUTAc12BACULOVIRUSFBOX