Science and Technology Production
Thesis
Authorship
Date
01/01/2010
Summary
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SIGEVA
El almidón es la principal forma de reserva de carbono en plantas superiores y constituye el polisacárido de mayor importancia en la dieta humana. Este polímero está formado por dos componentes mayoritarios: amilosa, que está compuesta predominantemente por cadenas lineales de glucosa con uniones α-1,4; y amilopectina, un α-1,4 α-1,6-glucano. La vía de biosíntesis de almidón involucra numerosas enzimas, como la ADPGlc pirofosfori...
El almidón es la principal forma de reserva de carbono en plantas superiores y constituye el polisacárido de mayor importancia en la dieta humana. Este polímero está formado por dos componentes mayoritarios: amilosa, que está compuesta predominantemente por cadenas lineales de glucosa con uniones α-1,4; y amilopectina, un α-1,4 α-1,6-glucano. La vía de biosíntesis de almidón involucra numerosas enzimas, como la ADPGlc pirofosforilasa (ADPGlc PPasa, EC 2.7.7.27); almidón sintasa (SS, EC 2.4.1.21) y la enzima ramificante (BE, EC 2.4.1.18). La almidón sintasa cataliza la extensión de cadenas de α-1,4-glucano, transfiriendo, a partir de ADPGlc, una unidad de glucosa al extremo no reductor de un polímero (amilosa y/o amilopectina) (Ball y col., 1996; Ball & Morell, 2003b; Martin & Smith, 1995). Se ha descripto la existencia de diversas isoformas de SS en plantas superiores: las formas solubles llamadas SSI, SSII, SSIII, SSIV/V y las SS unidas a gránulo, GBSSI y GBSSII. Se ha propuesto que una de las isoformas, la SSIII, tendría un papel regulatorio en la síntesis del almidón (Zhang y col., 2005) (Zhang y col., 2008) (Nicolas Szydlowski y col., 2009). En este trabajo se llevaron a cabo estudios sobre la estructura-función y regulación de la SSIII. Estudios bioinformáticos revelaron que esta proteína está compuesta por dos regiones, un extremo no catalítico N-terminal, que contiene 3 dominios en tándem de unión a almidón (SBD, starch binding domains); y un dominio catalítico (DC) en el extremo C- terminal. Los resultados mostraron que la SSIII utiliza ADPGlc preferentemente como nucleótido azúcar dador de grupos glucosilo. Además, usando la estructura cristalina de la glucógeno sintasa de A. tumefaciens como molde, se pudo obtener un modelo de la estructura global del DC de la SSIII, presentando un alto grado de conservación en los aminoácidos implicados en la unión de la ADPGlc. Por otra parte, demostramos que los SBDs presentes en el extremo N-terminal, tienen la capacidad de unir almidón. La determinación de las constantes de adsorción de las diferentes proteínas SBDs recombinantes (D1, D2, D3, D123 y D23) mostró que el módulo D23 es el que presenta mayor capacidad de unión al almidón. La caracterización cinética de proteínas SSIII truncadas conteniendo tres, dos, uno o ningún SBD reveló diferencias en los parámetros cinéticos para ambos sustratos, glucógeno y ADPGlc. Los resultados sugieren que los SBDs tendrían un efecto modulador de la actividad catalítica de la 1 RESUMEN enzima. Usando información de SBDs previamente caracterizados se pudo determinar que el dominio D2 posee sitios característicos de unión presentes en otros SBD como el de la glucoamilasa de A. niger. Mediante estudios de mutagénesis sitio dirigida se determinó que los aminoácido W340, W366 y W394 son los mayores responsables de la capacidad de unión de la proteína. Estudios complementarios sobre los SBD demostraron que el dominio SBD123 presenta mayor constante de adsorción (Kad) frente a amilosa que almidón y amilopectina, esta selectividad radicaría en el dominio D1. Se realizó además un análisis de la expresión de los diferentes transcriptos que codifican para las SSs en plantas de A. thaliana en líneas wt y mutantes nulas para SSIII (AtSSIII(-)) que expresan los dominios N-terminal (SBDs) o C- terminal (dominio catalítico) de la SSIII y se compararon con plantas wt y las mutantes nulas. Los resultados mostraron que la expresión de AtSSIII es tejido específica, mostrando sus mayores niveles en tejidos fotosintéticos y además su expresión estaría regulada por el ciclo día/noche. Además las líneas transgénicas presentaron un 20% menos de almidón (independientemente del background) y una alteración en los niveles de expresión del resto de las enzimas almidón sintasas (SSs). Por último, ensayamos la capacidad de los módulos D123 y D23 de unir diferentes polisacáridos, incluidos algunos componentes de la pared celular de plantas (celulosa microcristalina, pectinas y xilanos). Los resultados mostraron que ambas proteínas se unieron con mayor afinidad a estos tres sustratos que a almidón y que los dos sitios de unión a almidón identificados y característicos de los SBDs participan en la unión, reforzando la idea de promiscuidad versus selectividad y de la posibilidad de usar tales dominios como herramientas biotecnológicas sobre la pared vegetal.
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Key Words
BioquimicaAlmidón sintasas IIIAlmidónRegulación