Canales iónicos en células leucémicas y su relación con las proteínas CFTR y MDR.

Thesis

Summary *

La línea celular K562 deriva de una leucemia mieloide crónica humana y constituye un buen modelo para el estudio de los canales iónicos en células de origen hematopoyético. El interés en las células K562 radica en la posibilidad de seleccionar un cultivo resistente a sulfato de vincristina (K562-Vinc) mediante la exposición de las células K562 salvajes (K562-WT) a cantidades progresivas del citostático. De este modo podremos caracterizar el transporte iónico y su relación con el fenómeno de multidroga resistencia. Existen evidencias que la inducción de la P-glicoproteína (P-gp) o MDR-1 por exposición a compuestos citotóxicos, disminuye en forma reversible la expresión del canal de Cl- regulador de la conductancia en la fibrosis quística (CFTR). En adición, los niveles de P-gp aumentan significativamente en ratones knock out para el gen de CFTR. Sin embargo, la mayor parte de los estudios que relacionan la resistencia a citostáticos con la expresión del canal de Cl- CFTR están realizados en células de origen epitelial, siendo escasos los datos en células hematopoyéticas. Es importante destacar que si bien estos estudios muestran que la expresión del CFTR y la P-gp ocurre en una forma coordinada, no se realizaron experimentos para evaluar si esta regulación afecta la función del CFTR como canal iónico. Otro hecho que sugiere una relación entre el fenómeno de multidroga resistencia y el movimiento de iones, es que la P-gp pertenece a la familia de transportadores ABC, al igual que el CFTR cuya actividad como canal y también como regulador de otros canales iónicos fue extensivamente estudiada. La actividad del CFTR como canal iónico está regulada por AMPc (vía PKA) y ATP. Por otro lado, numerosos compuestos han sido utilizados para lograr una disminución o reversión de la resistencia a citostáticos. Algunos de éstos compuestos utilizados como reversores de la P-gp, en otras preparaciones son bloqueantes de los canales de Cl- y de Ca++. El objetivo general de la presente tesis es caracterizar el transporte de Cl- dependiente de AMPc en las células K562 y evaluar si el desarrollo de la resistencia celular a los citostáticos es acompañado por cambios en la expresión y/o funcionalidad de estos canales. Para ello, el efecto de la forskolina (un inductor de la síntesis de AMPc) sobre la actividad de los canales únicos fue estudiado en las células K562-WT mediante la técnica de patch clamp en la configuración de inside out. La forskolina indujo la actividad de dos canales aniónicos con mayor permeabilidad al Cl- que al gluconato. Uno de los canales presentó en una solución simétrica de NaCl, una curva I-V con rectificación saliente y conductancias de 20 pS y 40 pS, para pulsos hiperpolarizantes y despolarizantes, respectivamente. La glibenclamida y el DPC inhibieron la actividad del canal provocando una disminución de la probabilidad de apertura sin afectar la amplitud de corriente unitaria. En adición, la actividad del canal no fue modulada por las concentraciones de Ca++ intracelular. Todas estas evidencias indican que el canal hallado en las células K562 es el ORCC (outwardly rectifying chloride channel), ya que sus características son muy similares a las encontradas para este canal en otros tejidos. El segundo canal dependiente de AMPc encontrado en las células K562-WT presentó una curva I-V lineal y una conductancia de 11 pS, en una solución simétrica de NaCl. El canal es de naturaleza aniónica y tiene una mayor permeabilidad al Cl- con respecto al F- y al gluconato. La glibenclamida inhibió su actividad, provocando una disminución de la probabilidad de apertura y de la constante de tiempo abierto. El DIDS, otro bloqueante de los canales de Cl-, también inhibió en forma irreversible la actividad del canal, que se evidenció como una disminución de la Po, sin afectar la amplitud de corriente unitaria. Todas las características que describen al canal hallado en las células K562-WT son las esperadas para el canal de Cl- regulador transmembrana en la fibrosis quística, CFTR. En adición, la actividad del canal disminuyó con el agregado de anticuerpos anti-CFTR a la solución citoplasmática. La expresión de CFTR en las células K562-WT fue observada por las técnicas de RT-PCR y western blot, y la localización de la proteína en la membrana celular fue confirmada por inmunocitoquímica. Para evaluar los posibles cambios en la actividad de éstos canales en células que presentan multidroga resistencia se estudiaron las corrientes totales de las células mediante la configuración de whole cell del patch clamp. La forskolina estimuló corrientes totales en las células K562-WT y en las células resistentes a vincristina, que sobreexpresan P-gp. El incremento de las corrientes fue similar en las dos líneas celulares. La corriente neta activada por forskolina muestra una curva I-V con rectificación saliente en ambas líneas celulares, de acuerdo con los datos de canal único mostrados anteriormente. La utilización de los bloqueantes DIDS y DPC desde el lado extracelular nos permitió diferenciar los dos componentes de las corrientes dependientes de AMPc. Una fracción de las corrientes activadas por forskolina en las células K562-WT y K562-Vinc fue inhibida con DIDS (500 M) y la subsecuente adición de DPC (500 M) bloqueó corrientes remanentes. Los datos obtenidos indican que el 70 % de la corriente dependiente de AMPc es transportada por canales ORCC y un 30 % por canales tipo CFTR en las células K562-WT. Porcentajes similares se obtuvieron para las células K562-Vinc. Además, la forskolina en presencia de DIDS del lado extracelular, provocó la activación de una corriente en las células K562-WT y K562-Vinc. Esta corriente de comportamiento lineal frente al voltaje corresponde a la actividad del CFTR, ya que el ORCC fue inhibido por el DIDS. Es importante destacar que en presencia de DPC, bloqueante del CFTR y del ORCC, la forskolina no fue capaz de estimular corrientes en ninguno de los dos tipos celulares. El DPC y el DIDS no modificaron las corrientes basales, indicando que estas corrientes están generadas por otro tipo de canales. Para evaluar la correlación de los datos electrofisiológicos con la expresión del CFTR y MDR-1 se realizaron experimentos de RT-PCR y western blot. Las células K562-WT y K562-Vinc tienen niveles similares de ARNm de CFTR, mientras que se observó un incremento de 20 veces del ARNm de MDR-1 en las células resistentes a vincristina con respecto a las K562-WT. Similares resultados se obtuvieron por western blot indicando que en las células K562 el patrón de expresión y la funcionalidad del CFTR no se alteran con la presencia de MDR-1 en la membrana celular. Un punto importante para destacar es que la proteína MDR-1 o P-gp que se expresa en las células K562 es funcional. Los experimentos de citometría de flujo utilizando la sonda fluorescente Fluo-3 indican que existe presencia de P-glicoproteína funcional en ambas líneas celulares, pero la actividad de la misma es mayor en las células resistentes. Podemos concluir que el desarrollo de multidroga resistencia en las células leucémicas K562 no es acompañado por cambios en la expresión ni en la actividad de los canales aniónicos dependientes de AMPc (CFTR y ORCC) presentes en la membrana celular. Nuestros resultados indican que si bien la P-glicoproteína puede regular otros canales iónicos, como los canales de Cl- activados por hinchazón, éste no es un mecanismo general que se puede extender a todos los canales de Cl-. En adición, en nuestras condiciones experimentales, la P-gp no presentó actividad de canal iónico en las células K562. Information provided by the agent in SIGEVA