Estudio del mecanismo de activación del sistema regulatorio RcsC/YojN/RcsB y su participación en la virulencia de Salmonella enterica serovar Typhimurium

Tesis

Summary *

El sistema RcsCDB es inusual ya que consiste de tres proteínas, el sensor RcsC, el regulador de la respuesta RcsB, y un intermediario RcsD. Aunque se conocen numerosos factores que inducen el sistema, aún permanece desconocida la señal fisiológica. En Salmonella, el sistema Rcs puede ser activado por tratamientos o mutaciones que alteran la envoltura celular. Resultados del laboratorio, han demostrado que la sobreproducción de RcsB produce la activación del sistema aún en ausencia de la señal. Dicha activación requiere de por lo menos uno de los sensores RcsC o RcsD, para modular la expresión génica, ya que en dobles mutantes rcsC rcsD se anula dicha actividad. Esto demuestra que únicamente la forma fosforilada de RcsB es la forma activa, capaz de ejercer un efecto modulador. Por otro lado, demostramos que el sistema RcsCDB es activado en presencia del péptido permeabilizante (KFF)3K, por el crecimiento en membrana de nitrocelulosa, y por el agregado de trehalosa y ramnosa al medio de cultivo. Mediante el estudio de mutantes en enzimas que participan en la ruta metabólica de la dTDP-glucosa comprobamos que la mutante rfbA anula la activación del sistema RcsCDB por las diferentes vías probadas. Los ensayos con medios condicionados determinaron que los ligandos que activan el sistema son liberados al medio de cultivo y serían de naturaleza lipídica. De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio de la influencia de mutaciones de la vía metabólica Pta-Ack sobre la activación del sistema, se determinó que mutaciones ack acumulan acetil-fosfato que sería utilizado por RcsB para la activación del sistema Rcs en presencia de RcsC. Se demostró además que altos niveles de RcsB reprimen la expresión de rcsD, produciendo un estado de autorregulación negativo del sistema. En este estado el regulador RcsB es capaz de modular la expresión génica aún en ausencia de RcsD, lo cual apoya la hipótesis de trabajo. Los resultados de interacción in vivo demostraron que las proteínas de membrana RcsC y RcsD son capaces interactuar con el regulador RcsB. Estas proteínas fueron purificadas y se realizaron ensayos de fosforilación in vitro donde se observó la capacidad de autofosforilación de RcsC y RcsD, y de transferir el grupo fosfato a RcsB. Los resultados del estudio de expresión de genes reporteros del sistema (cps, flhDC, bap y asr) en mutantes de los promotores PrcsDB y PrcsB (donde está ausente el gen rcsD), demostraron que la concentración de RcsB alcanzada fue capaz de modular la expresión de dichos genes. Se determinó también que la mutante PrcsB presenta menor motilidad que la cepa salvaje, lo que se relaciona directamente con la represión del operón flhDC. Estos datos sugirieren que RcsB no requiere de RcsD para reprimir la expresión del flagelo y apoyan la hipótesis postulada. Además, ensayos de infección y replicación de S. Typhimurium en macrófagos, demostraron que las mutantes PrcsDB y PrcsB fueron suficientes para afectar la replicación de la bacteria dentro de células eucariotas, resultando en una disminución del número de viables aún en ausencia de RcsD. Information provided by the agent in SIGEVA