Ingenieria de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas

Thesis

Summary *

Las bacterias ácido lácticas representan microorganismos de gran valor alimentario,biomédico e industrial. Su aislamiento, caracterización y modificación son objeto de grandemanda, ya que sirven como potenciales probióticos, biofactorías de expresiónrecombinante o como vectores vivos de estrategias terapéuticas. Las herramientas másimportantes para estudiar las bacterias ácido lácticas y/o desarrollar cepas con nuevaspropiedades son los sistemas basados en plásmidos.El objetivo de esta tesis fue la generación y estudio de plásmidos para optimizar suuso como herramientas versátiles de marcaje fluorescente, expresión génica ymodificación génica para bacterias ácido lácticas. Se empleó la bacteria Lactococcuslactis MG1363 como huésped modelo.En primer lugar, generamos y caracterizamos nuevos vectores con elementosfuncionales en varios huéspedes bacterianos. Analizamos comparativamente laspropiedades de un conjunto de vectores de marcaje fluorescente construidos mediante lacombinación de: replicones promiscuos de la familia de pMV158 (pMV158 o pSH71),una gama de promotores constitutivos o inducibles funcionales en bacterias ácido lácticas,genes que codifican una proteína fluorescente (mCherry o EGFP) y diferentes marcadoresde resistencia a antibióticos (EryR, CmR o TcR). Se determinó la carga metabólica que lapresencia de dichos vectores impone a la célula bacteriana, la funcionalidad del sistemade expresión en varios huéspedes, las propiedades in vivo de las proteínas fluorescentesy el funcionamiento de los replicones en L. lactis (número de copias y estabilidadplasmídica). Estos vectores permiten el marcaje y la expresión génica estable o transitoriacon una amplia variedad de niveles de expresión.En segundo lugar, se construyeron vectores de herencia inestable para lamodificación génica de L. lactis utilizando el sistema CRISPR-Cas9 en vectores con elreplicón promiscuo pAMβ1 y promotores regulados por pH para la expresión del gen dela nucleasa Cas9. Se caracterizó la funcionalidad del sistema, la carga metabólicaasociada y las características del plásmido en L. lactis (número de copias y estabilidadplasmídica). Estos vectores permitieron la selección eficiente de cepas por curado deplásmido y selección de mutantes cromosómicas. Finalmente, se logró eliminar de formaexitosa el sistema de modificación para obtener cepas modificadas y libres de plásmidos.La presente tesis comprende la construcción y caracterización de nuevos vectoresplasmídicos funcionales en una amplia gama de huéspedes. Se demostró que el estudiode las características plásmido/huésped de los vectores empleados en las estrategiasbasadas en plásmidos permite optimizar el diseño y utilización de los mismos para cadaaplicación. Information provided by the agent in SIGEVA