Science and Technology Production
Thesis
Authorship
Date
15/03/2011
Summary
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SIGEVA
La glándula mamaria bovina es altamente susceptible a nuevas infecciones intramamarias (IIM) durante el periodo de involución temprana y periparto; estando el control clásico de estas IIM basado en el uso de antibióticos intramamarios. La búsqueda de estrategias alternativas con el objetivo de mejorar el sistema inmune de la glándula mamaria bovina durante este periodo podría favorecer la capacidad del animal para resistir a nuevas infecciones y ...
La glándula mamaria bovina es altamente susceptible a nuevas infecciones intramamarias (IIM) durante el periodo de involución temprana y periparto; estando el control clásico de estas IIM basado en el uso de antibióticos intramamarios. La búsqueda de estrategias alternativas con el objetivo de mejorar el sistema inmune de la glándula mamaria bovina durante este periodo podría favorecer la capacidad del animal para resistir a nuevas infecciones y evitar el uso de antibióticos cuyos residuos causan efectos perjudiciales tanto para la salud como para los procesos industriales. La inmunomodulación es definida como la modificación de la respuesta inmune por medio de la administración de sustancias que poseen la capacidad de regular el sistema inmune. Los modificadores de la respuesta biológica ó MRB son agentes que modifican la respuesta frente a organismos patógenos resultando en efectos profilácticos o terapéuticos beneficiosos para el hospedador. En este sentido, el ginseng, es la raíz de Panax ginseng C.A. Meyer (Araliaceae), y se ha reportado que sus extractos tienen efectos modulatorios sobre células fagocíticas, linfocitos y sobre la producción de anticuerpos tanto en humanos como en animales. El objetivo del presente trabajo consistió en describir los efectos inmunomodulatorios de una infusión intramamaria de Panax ginseng (P. ginseng) como MRB analizando parámetros de la inmunidad innata en glándula mamaria bovina al final de la lactancia. En el presente estudio se utilizaron 6 vacas no preñadas al final de la lactancia. La unidad experimental fue el cuarto mamario. Ocho cuartos mamarios fueron inoculados con 10 ml de extracto de Panax ginseng (EPg) (3 mg/ml), 8 cuartos fueron tratados con 10 ml de placebo (vehículo sin principio activo) y 8 cuartos fueron mantenidos como control (libres de inoculación). El ordeñe fue interrumpido inmediatamente después de las inoculaciones. La proliferación celular en los distintos cuartos mamarios inoculados fue evaluada mediante la expresión de PCNA por Inmunohistoquímica (IHQ). Además, la marcación y cuantificación de la expresión de citoquinas (TNF-α, IL-1α, IL-6) en tejido mamario se realizó por IHQ mediante anticuerpos específicos, cuya especificidad fue corroborada mediante western blot. La cuantificación de monocitos-macrófagos en los cuartos mamarios estudiados fue llevada a cabo también mediante la técnica de IHQ. Por otra parte, muestras de leche fueron colectadas de manera aséptica a distintos tiempos para la detección de ARNm de citoquinas mediante técnicas de RT-PCR y western blot. El RCS arrojó las mayores diferencias significativas a las 24, 48 y 72 hs post-inoculación (PI) en todos los cuartos tratados con el EPg comparado a los cuartos tratados con placebo y cuartos no inoculados (controles). No se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de proliferación de las células epiteliales y estromales mamarias entre los tres grupos evaluados, determinando que el tratamiento con EPg no afectaría al periodo de involución evaluado en el presente trabajo. El área inmunomarcada para TNF-α fue significativamente mayor en cuartos tratados con el EPg comparado a cuartos con placebo y cuartos controles. El análisis de los porcentajes de áreas inmunohistoquímicamente marcadas para las citoquinas IL-1α e IL-6 en los diferentes tratamientos evaluados, no mostró diferencias significativas, aunque si se observó un leve aumento de la expresión de estas citoquinas en cuartos inoculados con EPg comparado con los grupos placebo y controles. El tratamiento con EPg en cuartos libres de IIM mostró un incremento significativo en el número de monocitos-macrófagos durante el período de involución evaluado con respecto a cuartos tratados con placebo y a cuartos controles. Además, se evaluó la producción de TNF-α en secreción mamaria y tejido mamario por western blot. Para el análisis en secreción mamaria, no se detectó la proteína en muestras de placebo. Sin embargo, en cuartos tratados con el EPg se encontraron dos bandas de 17 y 26 kDa a las 24 y 48 hs PI. Además, se observó un incremento significativo en los niveles de la proteína soluble de 17 kDa de TNF-α a las 24 y 48 hs PI en cuartos tratados con EPg comparado con los restantes periodos evaluados. En tejido mamario, en condiciones reductoras, se encontró una banda de 26 kDa (proteína de membrana) y una banda de 17 kDa (proteína soluble) en los tres grupos evaluados. Se observaron diferencias significativas en la banda de 26 kDa en cuartos tratados con el EPg comparado con los otros grupos evaluados. Por otra parte, para el análisis de la banda de 17 kDa, si bien, no se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos evaluados, hubo una tendencia en aumento de la expresión de TNF-α en tejido mamario en muestras tratadas con EPg. Mediante RT-PCR se detectaron ácidos ribonucleicos mensajeros (ARNm) de IL-1α, IL-1β, IL-8 y TNF-α en células somáticas provenientes de leche de cuartos tratados con EPg y placebo, en contraste, no se detectaron los ARNm de IL-2, IL-4, IL-6 e INF-γ. Se observó un incremento significativo en la expresión de ARNm de IL-1α, IL-1β y TNF-α en cuartos tratados con EPg a las 48 hs PI comparado a cuartos tratados con placebo. Si bien, la dosis de EPg aplicada en el presente trabajo estimuló la expresión de ARNm de IL-8 en células extraídas de la leche a las 24 y 48 hs PI, no se observaron diferencias significativas entre los tratados con EPg como con placebo en cualquiera de los tiempos de ensayo evaluados. Los resultados obtenidos en el presente estudio y su discusión con los aportes de otros autores, permiten llegar a las siguiente conclusiones: la inoculación con el EPg en el secado se asoció con el incremento de células somáticas, con la estimulación del influjo y el reclutamiento de monocitos-macrófagos, con la presencia de la proteína TNF-α en leche y tejido mamario, y con la transcripción de ARNm de citoquinas proinflamatorias. Finalmente, se observó que el extracto aquí aplicado (P. ginseng) puede ejercer efectos inmunomodulatorios en glándula mamaria bovina y, por lo tanto, podría jugar un papel importante en la activación de las defensas intramamarias para el control de mastitis al momento del secado, ya sea usándolo solo o en combinación con la terapia antibiótica. Como complemento a este trabajo de tesis, se desarrolló un método de conteo celular directo como herramienta para la identificación de células somáticas en leche bovina para generar una técnica alternativa a la citometría de flujo (CF). Se utilizaron muestras de leche con diferentes RCS a partir de las cuáles se realizaron extendidos celulares los que se sometieron a IHQ para la detección de diferentes tipos celulares y a CF. Los análisis de correlación entre ambas técnicas demostraron que la técnica de identificación por método directo podría ser útil como alternativa a la CF para muestras con bajos RCS.
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Key Words
Glándula mamaria bovinaInmunomoduladorPanax ginsengInvolución