Caracterización funcional, cinética y estructural de enzimas involucradas en el metabolismo de azúcares-alcoholes y de rafinosa en plantas. Obtención de herramientas moleculares con aplicaciones en procesos biotecnológicos y de biorrefinerías

Tesis

Summary *

Este trabajo de Tesis se centra en el estudio de las enzimas que intervienen en el metabolismo del manitol en plantas de apio (Apium graveolens) y de la rafinosa en plantas de Brachypodium distachyon. De esta forma, se pretende mejorar la comprensión sobre los mecanismos moleculares que regulan dichas rutas metabólicas. Todas las enzimas fueron producidas de forma recombinante en Escherichia coli, fusionadas a una etiqueta de His en el extremo N-terminal y purificadas a homogeneidad electroforética por cromatografía de metal inmovilizado. La manosa-6P reductasa de apio se caracterizó cinéticamente en la dirección de reducción de manosa-6P y se determinó que su conformación cuaternaria se corresponde con un dímero, cuyas subunidades presentan una masa molecular de 35 kDa. Además, se logró cristalizar y resolver la estructura de esta enzima en presencia de ácido manónico y NADP+, constituyendo la primera estructura resuelta de una proteína de plantas perteneciente a la familia 2 de las aldo-ceto reductasas. De esta forma, determinamos que la Lys48 se encontraría involucrada en la unión del fosfato de la manosa-6P. Entonces, se construyó la mutante K48A, cuya eficiencia catalítica con manosa resultó mayor que para la enzima salvaje, mientras que dicho parámetro fue menor con manosa-6P que para la enzima salvaje. Estos resultados sustentan la importancia de la Lys48 en la unión del sustrato manosa-6P y, más específicamente, para la estabilización de su carga negativa. La manitol deshidrogenasa de apio fue caracterizada cinéticamente en presencia de los sustratos fisiológicos (manitol y NAD+), obteniéndose resultados similares a los reportados para la enzima purificada de fuente. También se determinó que, a diferencia de la conformación monomérica reportada previamente, la estructura de esta enzima es un homodímero de 80 kDa. Por otro lado, se obtuvo un modelo por homología de la enzima utilizando como molde la estructura resuelta de la sinapil alcohol deshidrogenasa de Populus tremuloides. Un análisis detallado del modelo nos permitió seleccionar los aminoácidos que determinan la especificidad por el cofactor NAD+. Entonces, se obtuvieron una variedad de mutantes de la enzima para cambiar su especificidad por el cofactor (de NAD+ a NADP+). De esta forma logramos obtener una enzima que puede utilizar NAD+ y NADP+ con la misma eficiencia catalítica.La UDP-azúcar pirofosforilasa de B. distachyon se caracterizó cinéticamente en el sentido de síntesis del UDP-azúcar y se determinó que su estructura cuaternaria es monomérica (86 kDa). Se observó que la enzima utiliza galactosa-1P y glucosa-1P con la misma eficiencia catalítica, pero dicho parámetro resultó ser un orden de magnitud menor para ácido glucurónico-1P. Además, la enzima fue capaz de utilizar otros azúcares-1P, pero con menor eficiencia que para los mencionados anteriormente. La galactinol sintasa de B. distachyon se estudió en el sentido de síntesis de galactinol. La enzima presentó una eficiencia catalítica tres órdenes de magnitud mayor con el sustrato fisiológico (UDP-galactosa) que con UDP-glucosa. Se construyó un modelo de la enzima por reconocimiento estructural, el cual permitió determinar los residuos implicados en la unión del metal y de los sustratos. La exposición de la enzima a los agentes oxidantes diamida y H2O2 redujo notablemente su actividad, la cual pudo recuperarse mediante la incubación con ditiotreitol o tiorredoxina de E. coli, sugiriendo que esta enzima podría ser regulada por mecanismos redox. Se estableció que la rafinosa sintasa de B. distachyon presenta una conformación monomérica de 80 kDa y que exhibe, al igual que las enzimas de otras especies vegetales, actividad glicosiltransferasa e hidrolasa. Hasta el momento no logramos caracterizar cinéticamente la enzima en sentido de síntesis de rafinosa, pero sí en el sentido de hidrólisis. La enzima fue capaz de utilizar como sustratos galactinol, rafinosa y melibiosa (un producto de degradación de la rafinosa), pero no estaquiosa ni maltosa.Finalmente, se crecieron plantas de apio bajo diferentes fotoperiodos (largo, normal y corto) para estudiar su efecto sobre la partición del carbono. Los niveles de glucosa y fructosa no mostraron patrones definidos en ninguno de los ensayos. Por el contrario, los niveles de sacarosa y almidón mostraron un claro patrón de acumulación durante las horas de luz y de depleción durante la noche en plantas crecidas con fotoperiodos normal y corto. Esto concuerda con resultados obtenidos para Arabidopsis y otras especies de plantas, en los cuales se reporta que la tasa de síntesis y degradación de sacarosa y almidón se encuentran finamente regulados por el reloj biológico para adaptarse al ciclo de luz/oscuridad establecido. También se llevó a cabo un ensayo donde las plantas de apio se sometieron a estrés por frío. Los resultados obtenidos sólo mostraron diferencias significativas en los niveles de almidón y de fotosíntesis entre las plantas control (crecidas a 23 °C) y aquellas sometidas a estrés por frío (crecidas a 10 °C). Los resultados plantean que es relevante determinar el contenido de manitol y las actividades de enzimas involucradas en el metabolismo del carbono. De esta forma, se obtendrá un panorama más completo sobre la regulación de las diferentes rutas metabólicas involucradas en la partición del carbono en hojas de apio. Information provided by the agent in SIGEVA